猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank中猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(porcine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)cDNA序列，设计1对引物。应用RT-PCR，分别从经过植物血凝素-P(PHA-P)或刀豆蛋白A(ConA)诱导的猪外周血单核细胞总RNA中扩增得到了猪GM-CSF cDNA，将其与pGEM-T Easy载体连接，经转化、筛选阳性克隆，进行了核酸序列测定。对核苷酸序列和推导的氨基酸序列分析表明，猪GM-CSF前体蛋白编码区由435bp组成，编码144个氨基酸，其中N端信号肽有18个氨基酸。在第44、47和54位氨基酸处有3个糖基化位点。与人、牛、羊、小鼠的GM-CSF核苷酸序列的相似性分别为82％、85％、88％和86％，氨基酸序列相似性分别为72％、73％、73％和57％。与人、牛、羊GM-CSF的亲水性和疏水性氨基酸的分布保守性很高，而与小鼠的差异较大。     

信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响

旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽（简称endo）、蜂素信号肽（简称mel）及gp67信号肽（简称gp67）分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组黏粒,将重组黏粒转染sf21细胞以得到杆状病毒。经扩增后大量感染细胞,检测E2蛋白表达情况,利用镍填料纯化得到E2蛋白,并进行蛋白糖基化水平鉴定及蛋白免疫原性分析。PCR鉴定结果显示成功构建了重组质粒。挑选白斑进行PCR鉴定,证实得到重组黏粒。Western blot检测结果表明,E2蛋白实现了分泌表达,进一步比较细胞培养上清中E2蛋白的表达水平,确定gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高。经镍填料纯化得到E2蛋白,SDS-PAGE结果显示其纯度较高,产率为25 mg·L^-1。通过ELISA分析其抗原性,结果表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体,其抗原性良好。将纯化后的E2蛋白添加ISA201佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,阻断ELISA结果显示,免疫后14 d即产生较高水平的猪瘟特异性抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。本研究为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

希金斯刺盘孢全基因组候选效应分子的预测

希金斯刺盘孢（Colletotrichum higginsianum Sacc.）是一种世界性分布的重要植物病原真菌，可引起严重的十字花科植物炭疽病，影响作物品质并造成严重的经济损失。效应分子在植物病原真菌侵染寄主植物过程中发挥着重要的作用。根据已公布的希金斯刺盘孢的全基因组信息，以其全基因组蛋白序列为材料，通过生物信息学方法，对其候选效应分子及其功能进行了预测和分析。首先利用SignalP、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor 和TargetP程序依次预测出其分泌类型的蛋白，再通过其序列大小和半胱氨酸含量作进一步筛选，最后利用blastp工具与非冗余蛋白质数据库进行比对，找出数据库中没有蛋白同源性的序列，从而获得候选效应分子；同时对希金斯刺盘孢全基因组的16 150个蛋白序列进行分析，最终预测到135个符合条件的候选效应分子，而大多数都是功能未知的假定蛋白。本研究采用生物信息学分析方法预测出了希金斯刺盘孢的候选效应分子，为进一步研究这些效应分子的功能奠定了基础，其研究技术和手段也为其它真菌效应分子的预测提供了重要的参考资料。     

茂源链霉菌MTG基因pMA5载体的构建及鉴定

[目的]提高MTG产量并实现简便有效的纯化过程,以枯草芽孢杆菌为宿主构建pMA5_(mtg)重组质粒。[方法]通过提取茂源链霉菌的基因组DNA,扩增mtg基因片段,再将异源信号肽与mtg基因片段进行融合,融合片段和pMA5质粒双酶切后连接,转化到大肠杆菌感受态细胞中,菌落PCR和测序获得阳性单克隆。然后将pMA5_(mtg)重组质粒转入枯草芽孢杆菌感受态中,通过抗性筛选和双酶切鉴定获取重组菌株。[结果]成功扩增出mtg基因片段,构建出重组质粒pMA5_(mtg)。[结论]获得pMA5_(mtg)重组表达菌株,为MTG的纯化及其未来生物工程的改造提供了有效的方法。     

谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体的构建及强信号肽筛选

强信号肽的使用是提高蛋白分泌效率的关键,筛选强信号肽具有重要的应用价值。本试验以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌基础穿梭载体pAU2为骨架,以枯草芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶AprE为报告蛋白,分别使用强启动子tac-M和谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点一致序列来控制报告基因的转录和翻译,成功构建谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体pAU20。分别对来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、以及谷氨酸棒杆菌中共16种Sec型信号肽编码序列进行PCR扩增,与pAU20连接,转化谷氨酸棒状杆菌,获得重组信号肽探测载体工程菌株。工程菌株摇瓶发酵培养物上清液AprE酶活测定结果表明,C. glutamicum/pAU20-Vpr、C. glutamicum/pAU20-BprA上清液比酶活分别为180.02和167.6U/mg蛋白质,均显著高于C.glutamicum/pAU20-cgr2070上清液比酶活(105.09 U/mg蛋白质);C. glutamicum/pAU20-oppA、C. glutamicum/pAU20-Epr、C. glutamicum/pAU20-cgr2063和C.glutamicum/pAU20-ywaD上清液比酶活分别为96.68、86.18、82.52和80.56U/mg蛋白质,均稍低于C. glutamicum/pAU20-cgr2070上清液比酶活。这些结果表明,信号肽Vpr、BprA、cgr2070、oppA、Epr、cgr2063和ywaD都属于谷氨酸棒杆菌强信号肽。     

瓜类果斑病菌（Acidovorax citrulli）基因组信号肽预测分析

利用Signal 3．0、LipoP和TargetP对瓜类果斑病菌Acidovorax avenae subsp．chrulli AAC00—1菌株基因组中4709个ORFs进行分析．对该病菌基因组中信号肽的数量、长度和氨基酸组成进行了预测,并对其进行分类。结果确定其中476个ORFs所编码的N-端有信号肽序列,占全部ORFs的10．10％。信号肽长度为14—48个氨基酸,以20～35个氨基酸居多．26个氨基酸的信号肽最多。组成信号肽的氨基酸中,非极性氨基酸占47．80％,极性氨基酸占23．04％．带负电荷的酸性氨基酸占15．87％,带正电荷的碱性氨基酸占8．73％。预测的476条信号肽中,有384条分泌型信号肽（SPI）,40条脂蛋白型信号肽（sPII）,51条TM}Ⅱ型信号肽和1条CYT型信号肽。在分泌型信号肽中,有96个信号肽具有RR—motif的保守区段。     

核盘菌一分支酸变位酶同源效应蛋白的亚细胞定位

前期研究表明核盘菌Sclerotinia sclerotiorum产生的一种分支酸变位酶同源效应蛋白能够提高其致病能力。为了进一步研究该效应蛋白在核盘菌致病过程中的作用机制,我们通过构建GFP融合蛋白对其分泌行为和亚细胞定位开展了研究。首先通过PCR技术扩增了该基因的启动区+信号肽(SP)+叶绿体定位肽(CTP)的DNA序列,构建GFP融合载体,然后借助REMI技术转化核盘菌原生质体,筛选GFP能够表达的转化子,最后接种转化子菌丝于烟草叶片,激光共聚焦检测GFP荧光信号,发现GFP荧光与叶绿体自体荧光共定位,表明该效应蛋白可分泌进入寄主叶绿体内发挥作用。     

全基因组预测稻瘟菌的分泌蛋白

【目的】分泌蛋白多为病原微生物与植物受体蛋白起作用的激发子和其它致病因子，深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制。利用稻瘟菌基因组学研究成果，结合计算机技术和生物信息学的方法，分析其分泌蛋白组学，将有助于全面掌握其致病因子的结构与功能。【方法】利用SignalP对稻瘟菌基因库中所有ORF的N-端信号肽存在与否进行预测，再依次通过Protcomp、TMHMM、big-PI Predictor和TargetP预测程序进行验证，寻找出所有可编码信号肽的基因。【结果】对11 108个稻瘟菌的ORF进行分析，最终预测出共有1 235个ORF可编码分泌蛋白。【结论】经验证此预测方法之可靠性较高，这为深入研究分泌蛋白组学奠定了基础。     

科技文摘

胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆与序列分析以胡萝卜幼苗为材料,提取基因组DNA,根据GenBank中的已知序列设计引物,利用聚合酶链式反应技术（PCR）体外扩增获得胡萝卜抗冻蛋白基因（AFP）,将其连接到pGEM-Teasyvector载体上,并对其进行生物学信息分析。结果表明：克隆的AFP基因片段全长1…206…bp,…其中编码区长1026…bp,共编码341个氨基酸,蛋白质分子量为38.048…ku,等电点为5.43,该蛋白为亲水性分泌型蛋白,有信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主。与GenBank中（A91926.1）     

分泌型Cecropin B 抗菌肽基因转化血橙提高其抗溃疡病水平

 为了利用Cecropin B（CB）抗菌肽基因提高柑橘对溃疡病的抗性,人工合成了两个含有信 号肽的Cecropin B 抗菌肽基因PR1aCB 和AATCB。洋葱表皮瞬时表达分析表明,与非分泌型CB 抗菌肽 相比,PR1aCB 和AATCB 抗菌肽在细胞间隙中优势积累。进一步构建了CaMV 35S 调控 PR1aCB 和AATCB 基因的植物表达载体,转化塔罗科血橙（Citrus sinensis Osbeck）上胚轴,获得转基因植株。GUS 组织化 学染色、PCR 和Southern blot 分析表明外源基因已成功整合入柑橘基因组。Real-time PCR 定量分析表明, 抗菌肽基因在转基因植株中成功表达。柑橘叶片离体抗性分析表明,转PR1aCB 和AATCB 基因植株的抗 性显著强于非转基因植株,其抗性水平与高抗品种‘南丰蜜橘’（C. succosa Hort. Ex Tan）和‘四季橘’ （C. madurensis）相当。