多杀性巴氏杆菌基因组分泌蛋白的预测分析

分泌蛋白对于细菌自身的生命活动以及在介导病原体与宿主之间相互作用的过程中发挥着重要的作用,深入研究分泌蛋白将有助于明确细菌的生命活动及与病原微生物互作的分子机制.利用多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)基因组学研究成果,结合信号肽分析软件SignalP v3.0、跨膜螺旋结构软件TMHMM v2.0、亚细胞器蛋白定位软件PSORTb和GPI-锚定位点软件GPI-SOM这4个软件,对多杀性巴氏杆菌2105个编码蛋白的ORF进行预测分析,最终获得了136个分泌蛋白.对其信号肽长度、氨基酸组成、相应ORF长度进行了统计.运用Blast P对其功能进行同源性分析,发现11个蛋白为多杀性巴氏杆菌所特有,这对多杀性巴氏杆菌的临床诊断具有一定的潜在应用价值.     

油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位、原核表达及其酶活分析

为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的cDNA序列。该序列含有一个长度为1 959bp的开放阅读框,编码蛋白为652个氨基酸,在N端含有一个由49个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列。将该信号肽序列构建至植物表达载体35S:: BnALS3-GFP,利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达,结果显示BnALS3蛋白定位在叶绿体中。构建去除叶绿体信号肽序列的BnALS3原核表达载体pCzn1-BnALS3,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测显示,在11℃条件下以终浓度为0.2mmol.L-1的IPTG诱导8h后,pCzn1-BnALS3基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白His-BnALS3呈部分可溶性,分子量约为67kD。酶活分析表明,原核表达的His-BnALS3最适反应pH值为7.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为6.55 mmol·L-1和6.40μmol·mg-1·h-1。     

添加前缀对重组蛋白生物学特性影响的预测分析

利用分子生物学软件DNASTAR对DAB389-αMSH和含有亲和标记、Xa factor识别序列、连接肽的DAB389（Gly4Ser）2-αMSH的表位、亲水性、等电点等生物学特性进行了预测分析。结果显示：DAB389（Gly4Ser）2-αMSH的表位为0.8,DAB389-αMSH为2.1;亲水性为2.7,高于DAB389-αMSH的1.96;两者的等电点均为5.9。His.Tag、Xa factor识别序列使重组蛋白的亲水性增强,表位降低;重组蛋白氨基端前70个氨基酸中不存在信号肽;DAB389（Gly4Ser）2-αMSH的表达量低于DAB389-αMSH2%左右,前缀对蛋白表达量有一定的影响。     

一种高效、稳定的可溶性原核表达载体的构建及应用

以O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-OVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有PelB信号肽编码序列的VP1 C端编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建了可溶性原核表达载体pET-30a-PelB-VP1C.将VP1全长编码区替换VP1C,获得重组原核表达载体pET-30a-PelB-VP1.将两种重组质粒分别转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,实现了VP1全长及其C端的可溶性表达,以金属离子螯合层析法分别对表达的VP1及其C端融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在32 ku和20 ku处有单一目的条带,具有较高的纯度.Western blot 分析,VP1蛋白及其C端均可与牛O型口蹄疫病毒阳性血清反应.对重组菌株的连续传代实验证实了该可溶性表达载体的遗传稳定性,显示了该可溶性原核表达载体在蛋白可溶性表达中的应用价值.     

虾肝肠胞虫全基因组分泌蛋白的预测分析

分泌蛋白是在细胞内合成后分泌到细胞外起作用的蛋白质,其在许多原生动物寄生虫操纵宿主细胞和影响虫体的毒力中起着重要作用。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是一种可感染多种经济虾类的专性细胞内寄生虫,是近年来影响全球对虾养殖生产较严重的病害之一。本研究利用真核生物分泌蛋白预测流程EuSecPred2.0对EHP全基因组的分泌蛋白进行预测,并对分泌蛋白长度、信号肽长度、切割位点处氨基酸分布等信息进行分析,对分泌蛋白功能进行分析。结果显示,分泌蛋白氨基酸长度主要集中在30~400 aa之间;信号肽长度集中在9~32 aa之间;信号肽切割位点处以疏水性氨基酸为主。对信号肽进行基序分析,发现存在基序NV[VT][IK]CA[ED][SA]。对所获蛋白质进行功能注释,发现了多种与微孢子虫黏附侵染、调节细胞周期和免疫反应等相关的关键蛋白。研究结果有助于了解EHP对宿主的侵染机制,同时为进一步明确EHP的致病相关因子提供理论依据。     

转枯草芽孢杆菌纤溶酶 (Bacillus subtilis fibrinolytic enzyme,BSFE) 基因烟草营养器官显微结构特征

转枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillus subtilis fibrinolytic enzyme ,BSFE)基因及其信号肽和前肽序列烟草与野生型烟草营养器官显微结构分析结果表明：二者在细胞形态上没有明显差别。但转基因烟草的细胞层次明显少于野生型烟草；转基因烟草的输导组织木质化程度明显高于野生型烟草，且韧皮部有退化现象存在。     

草鱼含信号肽分泌蛋白的预测分析

采用组合的信号肽分析软件SignalP 3.0,TMHMM 2.0,big-PI,TargetP 1.1和Lipop 1.0对已公布的522个草鱼ORF编码蛋白的N端氨基酸序列进行信号肽分析,同时系统分析了信号肽的类型及结构。结果表明,522个草鱼氨基酸序列中分泌蛋白有61个,占其基因组编码蛋白的11.7%。编码这些蛋白的可读框(ORF)最小值为127 bp,最大值为5032 bp,平均910 bp,引导它们的信号肽长度介于15～32个氨基酸之间,平均为21个氨基酸。通过对草鱼分泌蛋白切割位点信号肽类型分析发现具Ⅰ型信号肽的分泌蛋白有17个,Ⅱ型的有4个。草鱼分泌蛋白中,42个具可预测功能,19个为未知功能蛋白。已知功能的分泌蛋白主要集中于细胞代谢,细胞调控及转运,细胞膜结构,细胞的免疫等领域。     

植酸酶根特异表达载体的构建及大豆转化

应用PCR方法分别从胡萝卜基因组中扩增出96bp的外展蛋白信号肽编码序列片段,从拟南芥基因组中扩增出1454bp的pyk10启动子片段,用RT-PCR方法从无花果曲霉（Aspergillus ficuum3.4322）中扩增出phyA基因,长1347bp。然后,分别克隆到pMD18-T载体。应用已设计的限制酶切位点,通...