信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响

旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽(简称endo)、蜂素信号肽(简称mel)及gp67信号肽(简称gp67)分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组黏粒,将重组黏粒转染sf21细胞以得到杆状病毒。经扩增后大量感染细胞,检测E2蛋白表达情况,利用镍填料纯化得到E2蛋白,并进行蛋白糖基化水平鉴定及蛋白免疫原性分析。PCR鉴定结果显示成功构建了重组质粒。挑选白斑进行PCR鉴定,证实得到重组黏粒。Western blot检测结果表明,E2蛋白实现了分泌表达,进一步比较细胞培养上清中E2蛋白的表达水平,确定gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高。经镍填料纯化得到E2蛋白,SDS-PAGE结果显示其纯度较高,产率为25mg·L~(-1)。通过ELISA分析其抗原性,结果表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体,其抗原性良好。将纯化后的E2蛋白添加ISA201佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,阻断ELISA结果显示,免疫后14d即产生较高水平的猪瘟特异性抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。本研究为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

应用重组杆状病毒表达猪瘟病毒糖基化EO(Erns)蛋白

通过PCR方法扩增出包含糖基化信号肽的猪瘟兔化弱毒疫苗株E0 (Ems)蛋白基因,末端引入6×His标签序列,将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统pFastBacTM HT B载体中,将阳性重组质粒pF-E0转化DH10Bac感受态大肠杆菌,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组Bacmid质粒(rBac-E0).转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rAc-E0.经Western blot鉴定重组蛋白正确表达,且具有良好的抗原性;用糖苷酶PNGase F处理后重组蛋白分子量减小为32 ku,表明重组蛋白为糖基化蛋白.这为进一步研究E0蛋白的功能、亚单位疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础.     

应用重组杆状病毒表达猪瘟病毒糖基化E0(E~(rns))蛋白

通过PCR方法扩增出包含糖基化信号肽的猪瘟兔化弱毒疫苗株E0(Erns)蛋白基因,末端引入6×His标签序列,将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统pFastBacTMHT B载体中,将阳性重组质粒pF-E0转化DH10Bac感受态大肠杆菌,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组Bacmid质粒(rBac-E0)。转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rAc-E0。经Western blot鉴定重组蛋白正确表达,且具有良好的抗原性;用糖苷酶PNGase F处理后重组蛋白分子量减小为32 ku,表明重组蛋白为糖基化蛋白。这为进一步研究E0蛋白的功能、亚单位疫苗和诊断试剂的开发奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因密码子优化后在昆虫细胞中的表达

将猪瘟病毒E2基因密码子改造后,克隆入pFastBac1质粒载体,经转座、转染后构建重组杆状病毒.并对表达产物进行鉴定分析.结果:E2基因改造后与设计序列一致;成功获得了重组杆状病毒(BAC/SE2M),采用猪瘟E2单抗WH303进行Western-blot和ELISA鉴定,证明:表达的CSFV E2蛋白特异性好,纯化后的E2蛋白,可用于猪瘟抗体检测试剂盒的开发.     

猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

猪瘟病毒E2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达

将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应.     

非洲猪瘟病毒pF317 L在昆虫细胞中的表达及鉴定

为了获得可纯化的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pF317L蛋白并对其进行鉴定,试验采用基因合成的方法获得密码子优化的F317L基因,亚克隆至pFastBacⅠ载体中,构建重组杆状病毒中间转移载体,导入DH10Bac感受态细胞中,得到重组穿梭质粒,再转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒;将重组病毒感染sf9细胞,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白的表达;镍柱亲和层析纯化获得目的蛋白;对纯化的蛋白质进行磷酸化检测。结果表明:成功构建了重组转座质粒pFastBac-F317L,导入DH10Bac感受态细胞得到重组穿梭质粒rBacmid-F317L,再转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒AcNPV-F317L,重组病毒感染sf9细胞后获得重组蛋白,大小为36 ku,能够与His标签单克隆抗体和ASFV阳性血清发生特异性反应,有磷酸化修饰。说明获得了纯化的ASFV pF317L蛋白,且该蛋白质具有生物活性。     

猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒系统中的表达及纯化

采用杆状病毒表达系统表达并纯化猪瘟病毒E^rns蛋白,并对其反应原性进行鉴定。将猪瘟病毒的E^rns 基因克隆至pFastbac-HT-A 载体上,构建了pFA-E^rns重组质粒;经转座、转染后构建重组杆状病毒rBac-E^rns;通过优化接毒时间和接毒量等参数,最终确定表达条件。将表达产物采用亲和层析法纯化后,采用Western Blotting 鉴定E^rns 蛋白的反应性,并采用间接ELISA 方法对其应用进行了初步探索。结果显示,获得了重组杆状病毒rBac-E^rns,经Western Blotting 和间接免疫荧光(IFA)鉴定,该重组病毒能够与猪瘟阳性血清和E^rns 单抗发生特异性反应。纯化后的E^rns 蛋白纯度较好,浓度为0. 2 mg/ mL,经Western Blotting 方法鉴定证明,纯化后的蛋白与E^rns单抗和猪瘟阳性血清能够发生特异性反应;初步建立了间接ELISA 方法检测猪瘟抗体,证明表达的蛋白可以区分猪瘟阳性血清和阴性血清。表明本研究利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化了猪瘟病毒E^rns蛋白,纯化后的E^rns蛋白具有良好的反应性,可以作为开发鉴别诊断试剂的备选蛋白以及用于E^rns 蛋白的结构和生物学功能研究。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在昆虫细胞中的表达

为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒.将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2.转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对重组的表达蛋白进行分析.结果表明,重组E2蛋白大小为43.6 ku,与预期值相符,该蛋白能与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应,为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒奠定基础.     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。     

猪圆环病毒2型CAP蛋白在flashBAC杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

试验旨在通过真核表达系统表达猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2） CAP蛋白。以PCV2 TZ0601株为模板,将PCV2 CAP全基因及CAP去除信号肽的基因编码序列克隆至pOET3载体上,酶切与测序鉴定正确后,将重组质粒pOET3-CAP及pOET3-CAP-X转染sf9昆虫细胞。采用flashBAC杆状病毒表达系统表达PCV2 CAP及去除信号肽的CAP蛋白,通过间接免疫荧光法、SDS-PAGE 和Western blotting鉴定目的蛋白的表达。结果表明,真核表达质粒pOET3-CAP及pOET3-CAP-X构建成功,目的基因在sf9昆虫细胞中高效表达,得到的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,在25~35 ku处有蛋白条带,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别。试验结果为进一步制备PCV2亚单位疫苗及诊断抗原试剂盒的研发奠定了基础。     

Expression and Identification of Porcine Circovirus type 2 Capsid Protein Using flashBAC Baculovirus Expression System

The study was aimed to express CAP protein of porcine circovirus type 2 (PCV2) by eukaryotic expression system.The PCV2 TZ0601 strain was the template,the CAP protein with or without the signal peptide of PCV2 coding sequence were cloned into pOET3 vector.The constructed plasmid were confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing,then sf9 insect cells were transfected with recombinant plasmid pOET3-CAP and pOET3-CAP-X.The test was designed to express the CAP protein with or without the signal peptide of PCV2 by flashBAC baculovirus expression system.Expression of PCV2 gene were confirmed by indirect immunofluorescent assay (IFA),SDS-PAGE and Western blotting.The results showed that the eukaryotic expression plasmids of pOET3-CAP and pOET3-CAP-X were constructed successfully and the gene was highly expressed in sf9 insect cells.After expression,we could see our target band about 25 to 35 ku with SDS-PAGE and Western blotting.The immuno-reactivity of the protein was confirmed by antisera against PCV2.This would lay a foundation for a further study of PCV2 subunit vaccine and diagnostic antigen kit.     

绿色荧光蛋白基因与猪瘟兔化弱毒疫苗株E2基因在杆状病毒中的融合表达

为了研究猪瘟病毒E2糖蛋白的立体结构及生物学特性，将增强型荧光蛋白基因（EGFP）和猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCI.V）E2基因经PCR扩增后克隆至pBlueBacHis2A质粒，与杆状病毒DNA共转染后经PCR鉴定获得了含有EGFP和HCLVE2融合基因（GFPTE2）的重组杆状病毒rBACTE2-339，并将其感染sf9细胞后在荧光显微镜下观察到了亮绿色荧光．说明融合基因已初步表达。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

猪瘟病毒多表位基因的表达及其免疫原性分析

体外表达猪瘟病毒(CFSV)T、B细胞表位,并对表达产物的免疫原性进行分析.人工合成CFSV的多个T、B细胞表位及表位之间的连接linker基因,并将该基因插入pGEX-6P-1表达载体,经酶切和测序鉴定获得重组阳性克隆,成功构建了CFSV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pGEX-BT500,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,纯化表达产物并免疫兔.结果:通过IPTG诱导目的基因可高效表达,SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.9 mmol· L-1的IPTG进行诱导,7h后表达量最高,产物分泌表达,相对分子质量约43 ku,表达产量约占菌体总蛋白的30％.Western blotting检测表明,表达的融合蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应;兔攻毒试验表明所免疫表达产物可保护(根据发热反应评价)兔.结果表明表达获得的产物具有良好的反应原性,这为应用该融合蛋白制备CSFV免疫血清学诊断试剂和多表位疫苗研究奠定了基础.     

猪瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中的表达和免疫原性分析

【目的】 设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性, 为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】 利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH, 将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒, 转导HEK293T细胞, 经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】 pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定, 得到大小分别为8 172 bp的载体片段和1 521 bp的E2-GM-CSF基因片段, 表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体; 细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1 686 bp的条带, 表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组; Western blotting分析获得约70 ku的条带, 证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达; SDS-PAGE验证显示, 纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带, 纯度较高, 大小约70 ku; 小鼠免疫血清ELISA检测结果表明, 表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性, 免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体, 免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900, 免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8 100, 远高于E2蛋白的1∶1 800。【结论】 利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白, 为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗, 同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。     

猪瘟病毒蛋白E2、N^pro基因的克隆表达及纯化

克隆了猪瘟病毒（CSFV）石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。