猪泛素C端水解酶L1基因的克隆与序列分析

从人泛素C端水解酶L1(UCH_L1)基因出发,在dbEST数据库中同源搜索,找到1条与人UCH_L1基因编码氨基酸同源性较高且在香猪背最长肌中表达的EST(BM194679).通过电子克隆和进一步RT-PCR试验验证,获得猪UCH_L1基因全长cDNA序列,其全长 1 105 bp,开放阅读框(ORF)位于60～728 bp,编码223个氨基酸.同源性分析结果表明,与人、鼠UCH_L1基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为91.2%和86.5%,蛋白质序列同源性均为96.6%.对该基因编码蛋白的结构和功能预测显示含有2个典型的疏水性区域,不含有信号肽,存在1个UCH_L1(pfam01088)保守结构域和多个磷酸化位点,属UCH_L1蛋白家族,故将该基因命名为猪泛素C端水解酶L1基因(登录号AY495532).     

信号肽与分泌通路在毕赤酵母表达异源蛋白中的作用机制

针对毕赤酵母信号肽和蛋白分泌通路及其改造对外源蛋白分泌的影响研究进展作一综述。     

农杆菌VirD2蛋白的定位特异性改造

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)VirD2蛋白具有与单链T-DNA(ssT-DNA)共价结合并将其转运至植物细胞核,将外源基因高效整合进核基因组的功能;如果将该蛋白改定位于质体,则有可能利用其将外源基因携带进质体,建立质体转化新方法.本研究对VirD2蛋白的定位信号进行了改造,采用重叠延伸PCR突变技术对Vir2的N端核定位信号(NLS)编码序列进行点突变,对C端编码序列实施缺失突变,并在合成的突变VirD2(mVirD2)基因3’端连接上增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因,在其5’端加上或不加源自拟南芥(A rabidopsis thaliana)冷调节基因(AtCOR15A)的质体定位信号肽编码序列,分别构成pt-mVirD2-eGFP和mVirD2-eGFP嵌合基因,由CaMV 35 S启动子控制,经农杆菌介导整合进烟草(ic otiana tab ac um)核基因组.荧光检验显示,mVirD2带质体定位信号时绿色荧光集中于叶绿体,mVirD2不带质体定位信号时绿色荧光弥散在细胞质中,且两者的细胞核均无荧光,表明pt-mVirD2-eGFP嵌合基因表达的蛋白具有质体定位特性,并失去了核定位能力.该结果为今后探讨利用pt-mVirD2融合蛋白将外源DNA主动定向牵引进质体,实现质体高效转化研究提供基础资料.     

葡萄霜霉菌候选效应子RXLR5信号肽的鉴定

利用Getorf、SignalP 3.0、BLASTP等生物信息学软件和PERL语言从葡萄霜霉菌基因组中预测到一条编码RXLR-EER结构域的效应蛋白候选基因,将该基因编码的蛋白命名为RXLR5。将RXLR5信号肽SP5编码序列连接到pSUC2T7M13ORI载体并转化到酵母蔗糖酶缺陷菌株YTK12后,重组菌株能成功分泌蔗糖酶,促使棉籽糖分解成单糖,因此,能在YPRAA培养基上正常生长;同时生成的单糖能与TTC反应产生红色不溶于水的氯化三苯基四氮唑。由此推测,SP5具有信号肽活性,可能在RXLR5从葡萄霜霉菌细胞内泌到胞外的过程中起重要作用。     

鲫鱼肌间刺形成基因SOST的克隆表达研究

硬化蛋白(Sclerostin,SOST)是一种由骨细胞特异性分泌用于负调节骨形成的因子,为探究硬化蛋白SOST在鲫鱼肌间刺形成中的调控作用.本研究对鲫鱼SOST基因进行扩增,克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)-SOST,转化感受态细胞BL21(DE3),利用IPTG诱导蛋白表达,分析诱导时间与诱导浓度对SOST蛋白表达的影响,并比较SOST基因内源信号肽片段切除前后的表达效果.结果显示,鲫鱼SOST基因序列为636 bp,蛋白质分子量约为38 kDa.随着时间的递增,蛋白表达量逐渐增大,诱导时间为4 h左右表达量达到最高;不同IPTG诱导浓度对蛋白的表达效果影响不大,而信号肽的存在会强烈抑制该蛋白的表达.研究结果为进一步分析SOST基因在鲫鱼肌间刺形成过程中的影响提供理论依据.     

葡萄座腔菌候选效应子抑制了Bax诱导的PCD反应并促进烟草疫霉的侵染

 轮纹病是苹果生产中发生严重又难以防治的病害。为探究致病机理,本研究选择葡萄座腔菌的3个候选效应子进行研究。农杆菌介导的烟草瞬时表达显示,Bdo_01520、Bdo_11198、Bdo_11545都能够完全抑制Bax诱导的烟草PCD反应。酵母分泌系统测试表明3个候选效应子的信号肽都具有外泌活性。qRT-PCR测定候选效应子在葡萄座腔菌ZY7有伤接种苹果果实后的相对表达量,结果显示3个基因在病菌侵染36~72 h上调表达。在本生烟中瞬时表达Bdo_11198显著促进了烟草疫霉的侵染,并降低了疫霉菌侵染后本生烟中活性氧的积累。结果表明,葡萄座腔菌候选效应子可以通过影响植物的PCD反应和过氧化氢积累促进病原菌的侵染,研究结果为进一步研究葡萄座腔菌的致病机制提供了基础。     

溶解性多糖单加氧酶CBP21的高效分泌表达及与几丁质酶的协同作用研究

为实现溶解性多糖单加氧酶CBP21在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达,并对其与几丁质酶的协同作用进行研究,以大肠-枯草芽孢杆菌穿梭质粒p WB980为基本骨架,溶解性多糖单加氧酶为目的蛋白,构建了信号肽筛选载体,依据信号肽结构特征(正电荷与疏水性的差异)对Sec途径的13个信号肽进行了筛选,结果显示信号肽Ylq B引导分泌溶解性多糖单加氧酶的效率最高,其发酵液上清对胶体几丁质结合活力最高,上清中结合蛋白占总蛋白浓度为32.39%。进一步分别对CBP21和来自糖苷水解酶18家族粘质沙雷菌几丁质酶及来自糖苷水解酶19家族的嗜水气单胞菌几丁质酶Chi92的协同作用进行分析,表明CBP21对几丁质酶和Chi92活力均有促进作用,其中使粘质沙雷菌几丁质酶活力提高1.85倍,使Chi92(嗜水气单胞菌)活力提高2.35倍。上述研究为该溶解性多糖单加氧酶的工业应用奠定了基础。     

信号肽酶复合体催化亚基SPC18敲除细胞系的建立与鉴定

信号肽酶复合体(SPC)通过水解切除信号肽调控蛋白分泌,实验旨在研究信号肽酶复合体催化亚基SPC18对细胞行为、蛋白分泌功能的影响,探究其在乳腺生物反应器中的应用。本研究在人胚肾细胞HEK293细胞中,采用CRISPR-Cas9基因编辑技术使SPC18的2号外显子缺失碱基GGAAG,导致移码突变,建立SPC18敲除细胞系,检测SPC18缺失对细胞形态、细胞增殖和内源分泌蛋白基质金属蛋白酶9(MMP9)表达和分泌的影响。靶基因测序及SPC18蛋白检测显示,成功构建了SPC18敲除细胞系,细胞形态与野生型HEK293细胞无显著差异,但细胞增殖能力显著下降;SPC18缺失不影响内源性MMP9的表达,但蛋白分泌受到抑制。本研究建立了SPC18敲除细胞系,SPC18的缺失会影响SPC功能,为SPC在乳腺生物反应器中的应用提供了依据。     

希金斯刺盘孢全基因组候选效应分子的预测

希金斯刺盘孢（Colletotrichum higginsianum Sacc.）是一种世界性分布的重要植物病原真菌，可引起严重的十字花科植物炭疽病，影响作物品质并造成严重的经济损失。效应分子在植物病原真菌侵染寄主植物过程中发挥着重要的作用。根据已公布的希金斯刺盘孢的全基因组信息，以其全基因组蛋白序列为材料，通过生物信息学方法，对其候选效应分子及其功能进行了预测和分析。首先利用SignalP、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor 和TargetP程序依次预测出其分泌类型的蛋白，再通过其序列大小和半胱氨酸含量作进一步筛选，最后利用blastp工具与非冗余蛋白质数据库进行比对，找出数据库中没有蛋白同源性的序列，从而获得候选效应分子；同时对希金斯刺盘孢全基因组的16 150个蛋白序列进行分析，最终预测到135个符合条件的候选效应分子，而大多数都是功能未知的假定蛋白。本研究采用生物信息学分析方法预测出了希金斯刺盘孢的候选效应分子，为进一步研究这些效应分子的功能奠定了基础，其研究技术和手段也为其它真菌效应分子的预测提供了重要的参考资料。     

科技文摘

胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆与序列分析以胡萝卜幼苗为材料,提取基因组DNA,根据GenBank中的已知序列设计引物,利用聚合酶链式反应技术（PCR）体外扩增获得胡萝卜抗冻蛋白基因（AFP）,将其连接到pGEM-Teasyvector载体上,并对其进行生物学信息分析。结果表明：克隆的AFP基因片段全长1…206…bp,…其中编码区长1026…bp,共编码341个氨基酸,蛋白质分子量为38.048…ku,等电点为5.43,该蛋白为亲水性分泌型蛋白,有信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主。与GenBank中（A91926.1）