一种高效的莱茵衣藻电转化方法

【目的】为了探明莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii最佳的转化条件。【方法】将融合基因4CL-3aSTS与绿色荧光蛋白(GFP)分别作为目的基因,以aphVIII为抗性基因,采用电转化法将两种目的基因分别转入野生型(WT)莱茵衣藻和细胞壁缺失型莱茵衣藻(CC425)中。【结果】用巴龙霉素抗性筛选以及通过PCR验证与荧光共聚焦显微镜检测,证实目的基因在两种莱茵衣藻中成功表达。【结论】获得了一种高效的莱茵衣藻电转化方法,野生型衣藻转化率为11.07%,细胞壁缺失型衣藻转化率为49.67%。     

莱茵衣藻CrGPAT基因的克隆及分析

【目的】探究CrGPAT在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)油脂合成中的作用。【方法】通过RT-PCR方法克隆了莱茵衣藻CrGPAT基因,对其理化性质、信号肽、蛋白结构域、高级结构进行分析,构建系统发育树。采用荧光定量PCR检测CrGPAT基因表达量。【结果】结果表明,CrGPAT基因编码区全长为1 233 bp,共编码410个氨基酸。GPAT相对分子质量为102 kDa,等电点为4.94,平均疏水性为0.805,脂肪系数为17.85,分子式为C₃₅₃₆H₅₈₄₁N₁₂₃₃O₁₄₄₂S₄₁₅,不稳定指数为45.30,属于不稳定蛋白质,为非分泌蛋白且不具有信号肽和蛋白跨膜区。二级结构预测表明CrGPAT蛋白由4种结构组成,其中α螺旋占43.17%,是CrGPAT蛋白最主要的二级结构。同时,系统发育分析表明,CrGPAT与团藻(Volvox)亲缘关系最近。【结论】CrGPAT能够在衣藻体内正常表达且在缺氮条件下表达量会显著提高,为进一步提高莱茵衣藻体内油...     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。     

脑心肌炎病毒VP1基因的克隆与原核表达

【目的】为获得重组脑心肌炎病毒VP1蛋白。【方法】利用RT-PCR方法对脑心肌炎病毒的VP1基因进行特异性扩增,并在pEASY-Blunt Zero载体中进行克隆。测序正确后,用Nde I和Hind III对重组质粒进行双酶切,将目的片段连接入原核表达载体pET-30a,提取质粒pET-30a-VP1,将质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达和纯化。【结果】重组的结构蛋白VP1以包涵体的形式存在,纯化后获得的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在31.5kD处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-30a-VP1。【结论】以原核系统成功表达脑心肌炎病毒VP1蛋白,进一步为犬的脑心肌炎病毒的血清学检测奠定基础。     

康氏木霉HEX1蛋白的原核表达及纯化

【目的】对康氏木霉HEX1蛋白进行原核表达和纯化,为进行抗体制备及深入研究HEX1功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增康氏木霉hex1基因,构建pMD19-T-hex1重组克隆质粒,在此基础上构建pET28a-hex1表达载体,转化E.coli BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达,对重组HEX1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定。【结果】成功克隆了长660bp的hex1基因并构建了融合表达载体,HEX1蛋白在IPTG诱导下得到表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应,并纯化出了融合表达蛋白。【结论】康氏木霉HEX1蛋白在原核细胞中得到成功表达及纯化,获得了分子质量约为25ku的重组蛋白。     

转角质细胞生长因子-2基因红花研究

【目的】构建转角质细胞生长因子-2基因(KGF2)红花,为KGF2药用蛋白的生产奠定了基础。【方法】利用融合PCR方法扩增人源KGF2基因与拟南芥油体蛋白Oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建了重组质粒pOP-OL-KGF2,采用冻融法将质粒pOP-OL-KGF2转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,采用PCR检测筛选转基因红花阳性植株,SDS-PAGE检测Oleosin-KGF2融合蛋白的表达情况。【结果】成功构建了植物特异表达载体pOP-OL-KGF2,转染后共获得了12株转基因红花植株,其中2株鉴定为阳性,阳性率为17%,对转化植株进行DNA水平检测和蛋白水平检测,可知KGF2基因已经整合进红花基因组中,且有所表达。【结论】成功获得转KGF2基因的红花株系。     

猪IFN-α基因在干酪乳酸杆菌中的表达及反应活性鉴定

【目的】构建能够稳定表达猪α-干扰素(IFN-α)成熟蛋白的重组干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei CECT5276),为将其作为口服疫苗来提高动物机体免疫力奠定基础。【方法】从质粒pMD18-IFN-α扩增出猪IFN-α成熟蛋白基因,再将其定向克隆到干酪乳酸杆菌整合型表达载体pMJ67的lac启动子下游,得到重组质粒pMJ67-IFN-α,电穿孔转化干酪乳酸杆菌。抽提干酪乳酸杆菌基因组DNA,进行PCR扩增及测序鉴定。采用半定量RTPCR检测猪IFN-αmRNA在干酪乳酸杆菌中的转录水平;采用Western blot对重组干酪乳酸杆菌菌体进行分析,检测其表达产物的活性;用双抗体夹心ELISA法确定最适的乳糖诱导质量浓度。【结果】PCR扩增获得了501bp的IFN-α,成功构建了重组质粒pMJ67-IFN-α,转化干酪乳酸杆菌后获得了重组乳酸杆菌。半定量RT-PCR结果显示,IFN-αmRNA在诱导16h时表达水平最高;Western blot分析表明,构建的重组干酪乳酸杆菌成功表达出了相对分子质量约19ku的重组蛋白,其可与鼠抗猪IFN-α抗体发生特异性反应。ELISA结果表明,当乳糖诱导质量浓度达到8g/L时,猪IFN-α成熟蛋白的表达量达到最大,为1.3μg/L。【结论】将猪IFN-α成熟蛋白基因整合到干酪乳酸杆菌基因组中,构建的重组乳酸杆菌能够稳定表达猪IFN-α成熟蛋白。     

兔出血症病毒VPg蛋白的原核表达及抗体制备

【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Western blot检测其特异性。【结果】构建了pET-30a/VPg原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后,成功表达了VPg蛋白。用该蛋白免疫试验兔后,制备的多克隆抗体能与VPg蛋白特异性反应。【结论】成功表达了RHDV VPg蛋白,并制备了特异性良好的多克隆抗体。     

一步法构建莱茵衣藻叶绿体表达载体

为简化莱茵衣藻叶绿体表达载体构建步骤,将莱茵衣藻叶绿体中表达所需的DNA 元件组合,构建入可一步 TA 克隆插入靶基因的载体pTBNK,可直接用于在莱茵衣藻叶绿体表达靶基因。将EGFP 克隆至表达载体pTBNK,经 蓝白班筛选获得阳性转化子pTBNK-EGFP,通过基因枪转化衣藻叶绿体并获得阳性克隆。通过PCR 鉴定,EGFP 成 功整合至衣藻叶绿体基因组中。     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

家蚕丝腺生物反应器表达狂犬病病毒核蛋白

【目的】采用家蚕丝腺生物反应器这一蛋白高效表达系统,尝试建立一种高效、低廉、稳定生产狂犬病病毒核蛋白（RVNP）的技术体系,为生产基因工程疫苗奠定基础。【方法】通过RT-PCR方法克隆获得RVNP序列,采用家蚕丝胶蛋白基因（Ser1）启动子为特异性启动子,将RVNP构建到含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）筛选标记基因的piggyBac转座子表达载体（pBA3EGFP）中,并采用显微注射转基因家蚕技术构建家蚕丝腺生物反应器。【结果】G1代通过EGFP标记的筛选获得转基因家蚕阳性蛾区26个,蛾圈阳性率为59.09%。PCR实验证实RVNP已经整合到家蚕基因组中,Western blot分析表明RVNP蛋白可能附着于丝胶蛋白并随家蚕吐丝行为分泌到蚕茧中。【结论】获得了能够表达外源的RVNP蛋白的转基因家蚕品系,该系统有望成为高效、低廉、稳定地生产狂犬病基因工程疫苗的技术体系之一。     

利用转基因番茄表达血管内皮生长因子的研究

【目的】应用基因工程技术,获得表达血管内皮生长因子（VEGF）的转基因番茄植株,为以番茄作为生物反应器生产药用蛋白奠定基础。【方法】利用植物偏好的密码子改造合成VEGF基因全长,构建植物表达载体p1390RVEGF,通过农杆菌菌株EHA105介导将其T-DNA区转入到番茄细胞中,再生后获得转基因番茄植株,对其进行分子和蛋白水平检测。【结果】成功构建了植物整株表达载体p1390R-VEGF,建立了高频的番茄再生培养体系;PCR检测、Southern blot和Western blot检测结果表明,VEGF基因已经转入番茄中,并成功得到了表达。【结论】得到了转基因番茄植株和果实,且VEGF蛋白有良好的抗原性。     

茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆茶树（Camellia sinensis） 的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。     

重叠延伸PCR法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达

 【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用 RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法（splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR）把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染 BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸PCR法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

鹅β-防御素10基因的分离、鉴定与表达

【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10（avian β-defensin 10,AvBD10）基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建系统进化树,进行遗传进化分析;并应用荧光定量的方法对该基因的组织表达水平进行鉴定。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1 上进行原核表达,并对该重组蛋白进行纯化,测定体外生物学活性。【结果】从鹅肾脏组织中克隆出了鹅AvBD10基因,该基因的cDNA大小为207 bp,编码68个氨基酸。经遗传进化分析表明,该基因推导的氨基酸序列与鸭AvBD10的同源性最高,达92.7%。通过对重组蛋白抗菌活性的检测发现,该蛋白对12种致病性细菌均具有较强抑菌作用,但在高盐离子浓度下活性减弱。并且重组蛋白不具有溶血的特性。【结论】成功克隆并表达了鹅AvBD10基因,原核表达产物具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。     

捻转血矛线虫Hc38重组蛋白的表达纯化及抗原性鉴定

[目的]通过表达和纯化捻转血矛线虫新功能基因He38最大开放阅读框ORF1,确定完整的Hc38蛋白天然表达形式、分子量大小和免疫学活性鉴定,为研究该基因功能和基因工程应用奠定基础.[方法]参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的He38基因序列(AY594263)设计引物,PCR扩增目的基因并克隆到表达载体中,重组表达载体转化大肠杆菌后IPTG诱导表达,SDS-PAGE和薄层扫描检测分析表达产物,通过亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western bloting和ELISA方法检测其抗原性.[结果]Hc38基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白相对分子量约为68 KD,表达量占菌体蛋白总量的30;,亲和层析柱纯化出目的蛋白,并能被捻转血矛线虫病绵羊阳性血清和重组表达产物免疫小鼠血清识别,具有反应原性.[结论]实现了Hc38基因的原核表达和纯化,验证了Hc38基因在虫体内的表达形式和抗原性.     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果胶甲基酯酶Pcpme3基因真核表达及功能研究

 【目的】对辣椒疫霉果胶甲基酯酶Pcpme3基因进行真核表达,制备其特异性抗血清,为用Western blot检测该基因在辣椒疫霉致病过程中的功能奠定基础。【方法】利用TR-PCR分离鉴定Pcpme3的成熟肽片段,克隆于pPIC9K载体。将获得的表达载体转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和免疫家兔制备特异性抗体。【结果】酵母转化子经MD、MM平板筛选和G418抗生素筛选与PCR鉴定,获得Mut+/His+表型高拷贝重组转化子,经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵上清液,检测出43 kD的特异蛋白。重组蛋白免疫家兔制备特异抗血清,Western blot检测该基因在游动孢子侵染辣椒叶片中的表达,随着病情加重,该基因的表达逐渐增强,从而证明该基因参与了病菌的侵染致病过程。【结论】利用真核表达获得的蛋白制成特异性抗体可以有效地检测Pcpme3在辣椒疫霉侵染寄主过程中的功能特性。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。