转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA，通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先，利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率；其次，以R15材料作为受体，利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段，在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株，对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上，利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传；利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下，以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株；利用特异引物进行PCR检测结果表明，在检测的全部再生植株中，扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株，其中，收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传；对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明，外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异，相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花；另外，蛋白检测结果进一步表明，该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA，在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养，成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系，并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。

Molecular Biology Identification of Transgenic Cotton Lines Expressing Exogenous G10aroA Gene