捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆与表达及酶活性分析

根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因序列设计1对特异性引物进行RT-PCR,将得到的片段克隆到pMD19-T载体后进行序列测定和分析;将该基因的开放阅读框克隆到pET-32a(+)载体中,获得原核表达质粒pET32/AK并转化大肠杆菌BL21;重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE分析其表达情况;对重组蛋白变性、纯化后用梯度尿素对其进行连续透析复性,对复性后的重组蛋白用定磷法进行精氨酸激酶活性分析。结果表明从捻转血矛线虫总RNA中扩增出大小约为1 104 bp的DNA片段。该基因与GenBank中捻转血矛线虫AK基因的相似性为89%。SDS-PAGE电泳结果表明该基因获得了表达,重组融合蛋白相对分子质量大小约为60.3×103,主要以包涵体形式存在。Western blot分析显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。重组蛋白具有一定的酶活性,其最佳反应温度和pH值分别为30℃和7.5。结论:该重组蛋白表达成功并具有一定的抗原性和激酶活性。     

捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆与表达及酶活性分析

根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因序列设计1对特异性引物进行RT-PCR,将得到的片段克隆到pMD19-T载体后进行序列测定和分析;将该基因的开放阅读框克隆到pET-32a(+)载体中,获得原核表达质粒pET32/AK并转化大肠杆菌BL21;重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE分析其表达情况;对重组蛋白变性、纯化后用梯度尿素对其进行连续透析复性,对复性后的重组蛋白用定磷法进行精氨酸激酶活性分析。结果表明从捻转血矛线虫总RNA中扩增出大小约为1 104 bp的DNA片段。该基因与GenBank中捻转血矛线虫AK基因的相似性为89%。SDS-PAGE电泳结果表明该基因获得了表达,重组融合蛋白相对分子质量大小约为60.3×103,主要以包涵体形式存在。Western blot分析显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。重组蛋白具有一定的酶活性,其最佳反应温度和pH值分别为30℃和7.5。结论:该重组蛋白表达成功并具有一定的抗原性和激酶活性。     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。     

Hc38基因沉默对捻转血矛线虫L3期幼虫发育的影响

通过研究Hc38基因对捻转血矛线虫L3期幼虫发育的影响,探索Hc38基因功能,为利用该基因防治捻转血矛线虫的进一步研究提供依据。针对Hc38基因序列设计并合成特异性dsRNA和siRNA,采用浸泡的方法对捻转血矛线虫L3期幼虫进行RNA干扰(RNAi)试验,利用实时荧光定量PCR分析Hc38基因在L3期幼虫中的转录抑制效果,同时将dsRNA和siRNA浸泡24h后的L3期幼虫感染绵羊,研究Hc38基因的沉默对捻转血矛线虫L3期幼虫在绵羊体内发育的影响,定期采集绵羊粪便检查虫卵数,30d后剖检绵羊皱胃,检查荷虫数的变化。实时荧光定量PCR检测表明,各试验组Hc38基因的相对含量显著低于对照组(P<0.01),浸泡72h后,Hc38-dsRNA组和Hc38-siRNA组Hc38基因的表达量分别仅为对照组的32.27%和14.93%。绵羊体内干扰沉默效果显示,试验组Hc38干扰组虫卵减少率最高,为50%,减虫率最高,为48.6%。通过浸泡法导入的dsRNA和siRNA均能有效抑制Hc38基因的转录,同时Hc38基因的沉默与幼虫的发育密切相关,为捻转血矛线虫及其他寄生线虫的基因功能研究提供一种新的方法。     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因的原核表达

[目的]研究黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C（LDH-C）基因的原核表达及重组蛋白的纯化。[方法]采用RT-PCR方法克隆鼠兔LDH-C基因,并将其连接到表达载体pET-32a上,构建鼠兔LDH-C基因的大肠杆菌BL21（DE3）工程菌,通过IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析,使用亲和层析方法进行蛋白纯化。[结果]RT-PCR扩增出1条约1.0 kbp的条带,与预期结果相符;重组表达载体经PCR和双酶切鉴定,产生1个约1.0 kbp的目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量略大于45.0kDa以包涵体形式存在的融合蛋白;通过镍亲和层析柱进行纯化,得到了较纯的融合蛋白。[结论]黑唇鼠兔LDH-C基因被成功克隆和表达。 更多还原     

捻转血矛线虫H11部分功能域基因的原核表达与分析

    生物信息学软件分析表明,捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)ZJ株的H11抗原基因含有4个糖基化位点与1个锌结合区,为分析这些功能域在H11天然抗原诱导的免疫保护中的作用,对H11部分基因进行克隆和表达.参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的H11基因序列设计引物,扩增H11开放阅读框670～1710 bp的部分基因序列,命名为HPS(H11 partial sequence).基因片段与表达载体pET-28b分别以NdeⅠ、XhoⅠ酶切后构建重组表达载体pET-28b-HPS,并将其转入大肠杆菌BL21中,提取质粒经PCR和酶切鉴定获得阳性质粒并对其进行测序.结果表明,扩增得到的目的基因片段为 1041 bp,与已发表的ZJ株和国外株参考序列比较,核苷酸同源性分别为100%和98.8%.将重组表达载体用IPTG诱导表达,表达产物利用SDS-PAGE和Western-blotting检测表明,HPS基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量约为37.34 kDa,诱导6 h的蛋白表达量可达到58.9%.     

传染性鼻气管炎病毒gD基因表位的原核表达与纯化

[目的]对牛传染性鼻气管炎病-毒(IBRV) gD基因表位进行原核表达,并对表达产物进行纯化鉴定.[方法]利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C,并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD.将其转入BI21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达.表达的gD重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Western blot分析.[结果]重组表达质粒pET-28a-gD经PCR、双酶切及测序证明构建正确.SDS-PAGE表明,gD蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约48 ku,与预期的蛋白分子量一致.纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128mg//ml,免疫印迹结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好.[结论]成功表达了gD基因表位蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防IBR基因工程亚单位疫苗的候选抗原.     

捻转血矛线虫GST耐药基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25～48、55～63、92～106、113～124、139～147、170～189和195～205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。     

乙型脑炎病毒SA1444-2株E蛋白C端片段的克隆及原核表达

[目的]为进一步研制检测乙脑抗体试剂盒奠定了基础.[方法]以本实验室已构建的重组质粒pET-E(E为乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白)为模板,利用PCR扩增乙型脑炎病毒E蛋白基因3'端部分片段,克隆入原核表达栽体pET-32a( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析表达产物.[结果]所表达的融合蛋白分子量约为38KD,表达产物以水溶形式存在,37℃,诱导4 h的诱导培养条件最佳,表达量约占菌体总蛋白的20%.表达产物经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白.ELISA检测表明,表达的蛋白能与猪乙脑病毒抗体血清发生特异性反应,具有很好的抗原性.[结论]基因工程表达的JEV E蛋白有望成为重要的实验室诊断抗原.     

GST-Dot4融合蛋白的表达·纯化及鉴定

[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2(NS2)的表达及活性研究

 【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究#br#

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。     

兔岩藻糖基转移酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆兔岩藻糖基转移酶(FUT2)基因,并进行原核表达,为进一步研究RHDV的感染过程和致病机理奠定物质基础。【方法】从兔肌肉组织中抽提基因组DNA作为模板,PCR扩增出FUT2基因,然后将该基因亚克隆入原核表达载体pET30a中,获得重组原核表达质粒pET30a-FUT2。将该重组原核表达质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了FUT2基因,该基因长度为1 044 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET30a-FUT2,其诱导表达产物分子质量约为45 ku;表达的重组FUT2蛋白可与His标签抗体发生抗原抗体反应。【结论】成功克隆了兔岩藻糖基转移酶基因,获得了分子质量约为45 ku的FUT2蛋白。     

乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1基因的克隆、序列分析与原核表达

【目的】克隆乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1（melanocortin 1-receptor,MC1R）基因,并对其进行生物学分析和原核表达。【方法】采集乌骨鸡的肌肉组织,提取其总RNA,根据GenBank上公布的原鸡（Gallus gullus）MC1R基因序列设计引物,利用反转录RT-PCR克隆乌骨鸡MC1R基因,对其进行生物学分析,并构建原核表达载体pET32a-MC1R,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。【结果】乌骨鸡MC1R序列由945个碱基组成,编码314个氨基酸。成功构建了重组质粒pET32a-MC1R的原核表达系统,并且体外诱导获得了MC1R蛋白。【结论】成功克隆了乌骨鸡MC1R基因并分析了其与乌骨鸡乌色性状的关系,其与原鸡的亲缘关系最近,达99.4%,经原核表达获得了乌骨鸡MC1R蛋白。     

玉米大斑病菌STK1原核表达载体的构建及其表达

【目的】构建玉米大斑病菌STK1原核表达载体并进行表达,以期得到带有His标签的目的蛋白。【方法】根据GenBank中STK1(AY849317)的cDNA序列及原核表达载体pET28a(+)中的多克隆位点设计引物,进行STK1的克隆和原核表达载体的构建。将重组载体在原核表达体系中进行表达。通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白的表达,并利用Western blot技术验证该蛋白是否为目的蛋白。【结果】STK1在大肠杆菌中的表达主要以包涵体形式存在;蛋白的分子量约为40.8kD;经1mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导,9h后蛋白产量达到最高;经Western blot检测该表达产物具有His-6抗原性。【结论】玉米大斑病菌MAPK信号转导途径中的STK1在大肠杆菌中获得了表达,为今后STK1蛋白的多克隆抗体制备及功能研究奠定基础。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌ompH基因原核表达及抗原性鉴定

[目的]克隆、表达牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(ompH)并鉴定其抗原性.[方法]扩增牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的ompH基因,构建原核表达载体pET28a - ompH,转化大肠杆菌BL21( DE3)并诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定表达目的蛋白,利用Western blot检测该蛋白的抗原性.[结果]成功克隆、构建了牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的pET28a - ompH原核表达载体.诱导表达蛋白约38 kDa,Western blot检测重组蛋白具有良好的抗原性.[结论]ompH基因的成功表达为重组OmpH蛋白的血清学检测方法的建立、多克隆抗体的制备及疫苗的研制奠定了基础.     

抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。