猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。     

家蚕质型多角体病毒苏州株基因组片段2的克隆与分析

为了探讨呼肠孤病毒科依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRP)基因的遗传与变异,通过RT-PCR对家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)苏州株(BmCPV-suzhou)的S2片段进行了分段克隆,对各克隆的测序结果进行拼接,获得了S2片段的全长序列.分析显示,BmCPV-suzhou S2片段的全长为3 854 bp(GenBank登录号:CQ924586),含有1个3 678 bp的编码RDRP基因的开放阅读框,并分别在5′和3′端发现了保守序列AGUAA和GUUAGCC.RDRP的氨基酸序列比对分析结果显示,BmCPV-suzhou与BmCPV-china、BmCPV-1、舞毒蛾(Lymantria dispar)CPV-1(LdCPV-1)、马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)CPV-1(DpCPV-1)、舞毒蛾CPV-14(LdCPV-14)、棉铃虫(Heliothis armigera)CPV-14(HaCPV-14)的相似性分别为99%、97%、94%、94%、54%、55%.基于RDRP氨基酸序列的系统进化分析表明,BmCPV的不同株系与LdCPV-1、DpCPV-1聚为一类.     

家蚕同源异型结构域蛋白基因Bmvis的克隆及组织表达和亚细胞定位

同源异型结构域蛋白(homeobox,HOX)基因是对生物体的生长发育从时间和空间上进行调控的一类基因。Vis(vismay)属于同源异型结构域蛋白转化生长影响因子(transforming growth interacting factor,TGIF)家族成员,在脊椎动物的研究中表明TGIF是转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)信号转导途径中的转录抑制子,但在果蝇(Drosophilamelanogaster)的研究中发现其是一种转录激活子。基于为探究家蚕(Bombyx mori)中vis基因的功能提供基础信息的目的,在电子克隆的基础上通过RT-PCR从家蚕5龄幼虫精巢cDNA中克隆了长度为847 bp的vis基因(Bmvis)片段(GenBank登录号:JF412700)。蛋白结构分析表明Bmvis在HOX结构域的螺旋区和TALE区段内高度保守,同时在HOX结构域外的C末端大约20个氨基酸也是高度保守的。进化分析显示昆虫的Vis与Achi(achintya)聚为一类,但Vis与Achi根据物种分类关系聚在一起。对Bmvis在家蚕5龄第3天幼虫组织中表达的RT-PCR检测显示其仅在精巢中表达。将Bmvis进行原核表达后获得抗Bmvis多克隆抗体,亚细胞定位显示Bmvis在细胞核和细胞质中均有表达,但主要分布在细胞核中。     

家蚕蛹虫草对小鼠免疫调节的影响

以小鼠为试验动物 ,对家蚕蛹虫草的免疫调节作用进行了研究。结果表明 ,家蚕蛹虫草无增加小鼠血清溶血素抗体积数作用 ,但可提高腹腔巨噬细胞的吞噬率 ,对二硝基氟苯 (DNFB)诱导的小鼠迟发型变态反应无增强作用 ,可显著提高小鼠NK细胞的活性 ,对小鼠体重及小鼠脏器 /体质量的比值无影响 ,表明家蚕蛹虫草具有免疫调节作用。     

6×His-猪生长激素融合基因在家蚕生物反应器中的表达

将通过PCR技术改建并去除了信号肽的猪生长激素cDNA基因克隆入转移载体pBacPAK His1,构建了重组转移载体pPGH0 30 ,进而将pPGH0 30与线性化病毒Bm BacPAK6共转染BmN细胞 ,成功获得了猪生长激素重组杆状病毒Bm BacPAK6 pgh。感染重组病毒的细胞可溶性蛋白SDS PAGE和Western blot分析结果显示 ,感染细胞蛋白电泳带的 2 5kD处有 1条猪生长激素特异带。Bm BacPAK6 pgh的BmN细胞培养液接种家蚕 5龄幼虫和蛹 ,感病幼虫与蛹血淋巴的SDS PAGE和Western blot分析结果表明 ,6×His 猪生长激素融合基因在家蚕体内得到了表达 ,特异性条带大小约为 2 5kD。     

SARS-COV S蛋白在大肠杆菌和家蚕中的表达

将SARS-CoV S蛋白基因的部分序列(accession number为AY304495的22 908-23 542 nt区域),克隆到表达载体pET28 a(+)中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,重组S蛋白的分子量约为27 kD,与理论分子量相符。将S蛋白基因的部分序列克隆入杆状病毒转移载体pBacPAK-H is后,与线性化家蚕杆状病毒BmBacPAK-6共转染BmN细胞,经空斑筛选获得重组杆状病毒BmBac-S,并将其在细胞和家蚕中进行表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,表达产物的分子量约30 kD,用金属螯合亲和层析纯化得到家蚕细胞表达的重组S蛋白。     

家蚕核型多角体病毒p35基因的核苷酸序列分析

对家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)p35基因的序列分析表明 :BmNPVsup35编码序列为 897nt,编码 2 98aa。同源性分析表明 :BmNPVsup35与BmNPVT3、AcNPV、SlNPV在核苷酸水平上同源性分别为 99.5%、95.1 %、89.3% ,在氨基酸水平上的同源性分别为 98.7%、89.4 %、76.4 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BmNPVT3中位的N14 6、S2 0 2 、E2 0 4 、K2 4 4 ,在BmNPVsu中分别被G、N、Q、N取代 ,BmNPVT3中S2 2 2 ,在BmNPVsuP35中发生了缺失。推测BmNPVsuP35蛋白的功能及抑制细胞凋亡的能力与BmNPVT3P35蛋白的相似     

稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立稳定转化家蚕细胞持续表达外源基因的技术体系,构建了基于piggyBac转座子的带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)和新霉素抗性基因(neo)表达元件的转基因载体pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA-fib-L-intron1,以及带有hGM-CSF和吉欧霉素(zeocin)抗性基因的昆虫细胞转化载体pIZT-IE-hGM-CSF,分别转染家蚕卵巢BmN细胞,并以含相应抗生素G418或zeocin的培养液筛选,得到稳定的转化细胞系FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF。ELISA检测结果显示,hGM-CSF在FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF转化细胞系的表达水平分别为1.534 55 fg/个细胞和2.227 38 fg/个细胞。     

家蚕丝素蛋白H链基因启动子区域的克隆及活性分析

家蚕(Bombyxmori)丝素蛋白H链基因(fib-H)具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为利用其时空调控机制,通过PCR扩增方法克隆fib-H启动子片段,并进行序列分析,进而构建由fib-H启动子控制报告基因DsRed的重组载体pSK-FH-DsRed-PolyA,通过家蚕BmN细胞和丝腺进行瞬时表达。结果表明:克隆的fib-H启动子序列具有典型的丝腺特异性表达启动子的特征,并可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。