抗禽流感或传染性喉气管炎两种重组鸡痘病毒疫苗联合免疫的相互影响

“表达H5N1禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒（rFPV—AI）疫苗”以及“表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV—ILT）疫苗”均已在实现商业化生产。由于两种疫苗使用了相同的载体病毒,如何使用才能减少相互干扰而产生最好的免疫效果。本研究设计了三个试验组：1）免疫rFPV—AI后间隔4周接种rFPV—ILT;2）rFPV—AI和rFPV—ILT混合后接种;3）将rFPV—AI和rFPV—ILT分别在两个翅膀同时免疫。结果表明,试验鸡接种rFPV—AI后4周接种rFPV—ILT,对传染性喉气管炎病毒WG株攻击的保护率为60％（6／10）,低于rFPV—ILT单独免疫组的保护率（100％,10／10）;rFPV—AI和rFPV—ILT混合后免疫组对禽流感病毒强毒攻击的保护率为80％（8／10）,对传染性喉气管炎病毒强毒攻击的保护率为70％（7／10）,而rFPV—AI和rFPV—ILT分两点同时接种对两种病毒攻击均能产生完全保护。本试验结果建议将这两种相同载体的重组病毒疫苗分两点同时接种以避免相互之间的干扰。     

抗乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1单克隆抗体的制备与鉴定

本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2株非结构蛋白NS1作为免疫原.免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,共获得4株特异性针对JEV NS1的杂交瘤细胞,分别命名为1H6、2C3、3A7、4C8,经测定1H6单抗亚类属于IgG2b,其他3株为IgG1,轻链均为K链.4株杂交瘤细胞诱生小鼠腹水效价分别达1:20 480、1:2 560、1:20 480、1:10 240,western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体均可与JEVNS1蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验表明1H6、3A7、4C8 3株单抗能够识别天然的JEV NS1蛋白.本研究为进一步探究JEV NS1蛋白结构及其功能奠定了基础.     

表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

将PCR扩增的高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)HuN4株GP5基因与含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达盒插入到伪狂犬病毒通用转移载体pgG-uni中,构建了转移载体pgG-HPGP5-EGFP.通过磷酸钙法将转移载体pgG-HPGP5-EGFP和PRV Bartha-K61株的基因组共转染Vero细胞,经过8轮荧光蚀斑筛选和PCR鉴定获得了稳定表达EGFP的重组病毒,命名为rPRV-HPGP5.WA和western blot结果证实HP-PRRSV HuN4株GP5在重组病毒中得到了有效表达.该重组病毒的获得为高致病性猪蓝耳病基因工程疫苗的研究奠定了基础.     

葡萄球菌肠毒素C基因的克隆表达及其生物学活性鉴定

为表达和纯化金黄色葡萄球菌(金葡菌)超抗原毒素,本研究从金葡菌中克隆葡萄球菌肠毒素C2(sec2)基因,构建了表达葡萄球菌肠毒素C与谷胱甘肽硫转移酶(GST-SEC)融合蛋白的重组质粒(pGEMSEC),通过大肠杆菌表达、亲和纯化、酶切、再亲和纯化,建立了便于大量制备高纯度的重组SEC(rSEC)的简便方法.此外,通过酶联免疫试验及双向琼脂扩散试验检测了rSEC免疫反应性,并通过测定rSEC刺激鼠脾细胞产炎性因子来检测了rSEC的超抗原活性.结果表明,rSEC与野生型SEC具有相同的免疫反应性和超抗原活性,为在今后对该超抗原进行进一步应用性开发和构建定点减毒诱变奠定了工作基础.     

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础.     

猪呼吸道疾病综合征

流行病学及现地调查表明,猪呼吸道病综合征(PRDC)是一种多因子性疾病,它是由病毒、细菌、不良的饲养管理条件及易感猪群等综合因素相互作用而引起的疾病综合征;实验研究从另一方面表明PRDC与猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体有紧密的相关性,这四种病毒是原发原因。因此,建立迅速的、多重的、高通量的检测方法是防止该病发展而造成严重危害的首要前提,完善诊断手段将成为它的有效防治措施。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据PRRSV HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA.将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4.并在病毒cDNA 5′末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切位点用于线性化pHuN4;此外,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记.pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在Marc-145细胞中救获病毒.结果显示:救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异.利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100％,在感染后20 d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆,为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台.     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位多肽序列鉴定及分析

为了对流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白抗原表位E19进行核心序列定位,本研究设计了一系列编码相互部分重叠短肽核苷酸序列,原核融合表达后经western blot分析,确定其抗原表位核心序列为150ENHGNYS156.该表位在乙型脑炎不同基因型的各种病毒株间为高度保守序列;根据JEV E19表位与同一血清群其他黄病毒之间的差异,在同源序列位置设计了系列突变短肽,融合表达后western blot分析的结果表明,其他黄病毒属病毒同源序列不能与抗JEV阳性血清反应.本实验结果表明JEV E蛋白抗原表位E19具有鉴别检测JEV与西尼罗病毒等其它黄病毒的意义.本实验为进一步研究E蛋白结构和功能以及建立乙型脑炎临床鉴别诊断方法奠定了分子生物学基础.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白B表位诱导中和抗体能力的研究

为证实GP5蛋白B表位是否具有诱导抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中和抗体的能力,本实验合成了PRRSV CH-la株和高致病性PRRSV(HP-PRRSV)HuN4株B表位的短肽,分别免疫家兔制备两份特异性多肽抗血清.此外,将12头PRRSV及其抗体均为阴性的健康仔猪以HP-PRRSV HuN4疫苗毒株(HuN4-F112)进行基础免疫,然后用强毒株(HuN4-F5)进行多次接种,制备猪高免血清.间接免疫荧光检测(IFA)结果显示,两份多肽抗血清均能与PRRSV经典株和变异株发生特异性反应,IFA抗体效价无差异,表明两份血清没有显著差异.病毒中和试验结果表明,两份多肽抗血清均不具有中和PRRSV活性.间接ELISA和病毒中和试验结果表明,猪高免血清中针对B表位肽的ELISA抗体水平与血清抗PRRSV中和抗体之间没有正相关关系,而且B表位肽不能抑制中和抗体.以上结果表明HP-PRRSV B表位不能诱导产生中和抗体.     

论肉禽无禽流感生物安全隔离区的建立

生物安全隔离区划(compartmentalisation)是世界动物卫生组织(OIE)2003年提出的动物疫病区域化管理新模式.改革开放以来我国出现的一批规模化肉禽企业,为我国实施禽流感生物安全隔离区划奠定了良好基础.论文根据农业部2009年发布的肉禽无禽流感生物安全隔离区(AI-free compartment)相...