携带猪流行性腹泻病毒S1抗原表位的乙肝核心抗原病毒样颗粒的构建与鉴定

旨在构建以乙肝核心抗原（HBcAg）为载体呈现猪流行性腹泻病毒（PEDV）S1抗原表位的病毒样颗粒。将PEDV S1蛋白中含B细胞表位的270 bp片段插入到HBcAg主要免疫显性区域（MIR）,构建重组质粒pET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1,转化到感受态细胞BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定纯化后的重组蛋白,通过透射电镜观察其形态结构。结果显示,成功构建重组质粒pET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1,并在BL21（DE3）中以包涵体形式表达,纯化、复性后的重组蛋白经过2%磷钨酸负染后透射电子显微镜检测到病毒样颗粒结构。HBcAg-PEDV S1重组蛋白能够自发形成病毒样颗粒,在原核表达中,乙肝核心抗原可作为载体呈现PEDV S1抗原表位,为今后新型PED疫苗的研究提供了思路。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV）检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10¹~3.31×10⁷拷贝·μL^-1模板量时,呈良好的线性关系,相关系数（R²）为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10¹拷贝·μL^-1,组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^6.7、10^5.3拷贝·mL^-1。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。     

新疆某牛场大肠杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

为了调查新疆某规模化奶牛场犊牛腹泻的原因并确定病原,无菌采集15份腹泻犊牛粪样进行病原的分离培养,采用形态学观察、生化试验、血清学和致病性分析等方法鉴定分离菌株,利用大肠杆菌16S rRNA通用引物进行基因序列扩增并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的其他菌株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树并进行分析,同时对分离菌株的黏附性基因进行鉴定。结果从15份样品中分离获得2株分离菌株;试验显示,分离株均发酵葡萄糖,MR试验、吲哚和甲基红试验呈阳性,硫化氢、氧化酶、DNA酶、VP试验呈阴性。2株分离菌株血清型均为O78,且均具有致病性。药敏试验显示,分离菌株均对环丙沙星、卡那霉素、氟哌酸、庆大霉素、磺胺甲唑、头孢哌酮、壮观霉素、多黏菌素B、呋喃妥因敏感。分离株16S rRNA基因序列与大肠杆菌菌株NF738(GenBank登录号:MT649856)同源性为≥99.7%,且处于同一大分支。经PCR鉴定,分离菌株具有K88黏附性基因。本研究结果证实了引起新疆某规模化奶牛场犊牛腹泻的病原为致病性产肠毒素型大肠杆菌。     

牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展

引起牛病毒性腹泻/黏膜病(bovine viral diarrhea—mucosal disease,BVD—MD)的病原为牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV),牛感染后会出现与其他腹泻病相似的症状,仅通过临床表现和病理观察很难做出准确鉴别;其次持续感染(PI)牛是该病主要传染源,如何鉴别、净化牛场中PI牛十分重要。为了检测BVDV病原和净化PI牛,选择一种最佳的检测方法非常重要。文章对目前常用的不同BVDV检测方法进行了比较分析。不同检测方法在敏感性、特异性等方面均存在差异。实际应用时应根据检测目的综合考虑,选择适宜的检测方法。     

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测方法的建立

用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立BVDV抗原捕获ELISA(AC-ELISA)检测方法,优化反应条件并对该方法的稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为5μg/mL,兔多抗血清最佳质量浓度为10μg/mL;单抗在4℃包被12~24 h,多抗在37℃作用1 h为双抗体的最佳反应条件;酶标抗体最适稀释度1∶10000,最适作用时间为1 h;采用1%BSA和1%明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭效果好。用AC-ELISA方法检测临床采集的11份牛腹泻病料和12份健康牛组织样品,同时以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比,3种方法符合率很高。研究表明AC-ELISA方法稳定性好,可用于BVDV的临床快速检测。     

松乳菇多糖对早期断奶乳猪生产性能和预防腹泻的影响

实验设3个松乳菇多糖添加剂组、1个抗生素（杆菌肽锌）添加剂组和1个基础日粮对照组,研究5种日粮对早期断奶仔猪生长性能、饲料转化率及腹泻影响,探讨松乳菇多糖作为饲料添加剂效果。结果表明,75、150 g/t添加松乳菇多糖组与基础日粮组相比日增重、料肉比和耗料量、腹泻率、腹泻指数没有显著差异;300 g/t添加松乳菇多糖粉与基础日粮组和抗生素组相比,日增重和耗料量分别提高15.06%和10.67%;料肉比和腹泻率分别降低4.05%和14.28%;降低饲料成本3.13%。     

免疫增强剂-巴罗顿对断乳仔猪生长性能的影响

选取128头7～8 kg"杜长大"健康断乳仔猪作为试验动物.根据体重相近、公母各半的原则将其随机分为对照组和试验组,每个组设4个重复,每个重复16头.探讨添加免疫增强剂--"巴罗顿"对仔猪生长性能和腹泻率的影响.对照组饲喂基础日粮,试验组在每千克基础日粮中添加2g巴罗顿.结果表明,在每千克仔猪日粮中添加2g巴罗顿对仔猪的生长性能没有产生显著影响(P＜0.05),有减少仔猪腹泻的趋势.     

强制补饲对早期断奶仔猪腹泻及消化道的影响

选用二元杂交仔猪10窝,随机分为对照组和试验组,8日龄时开始补饲,对照组自由采食,试验组在自由采食基础上,增加强制补饲至21日龄.结果表明,强制补饲可明显增加28日龄断奶仔猪断奶前的饲粮采食量:试验组(600.6±29.97)g,对照组(202.6±16.59)g(P<0.01);断奶前后日增重显著提高(P<0.01);断奶后仔猪腹泻频率显著降低:试验组(14.78±2.13)%,对照组(45.75±6.26)%(P<0.01);28日龄胃内pH值低于4,显著低于对照组(P<0.05);肠道内大肠杆菌数量显著低于对照组(P<0.01);35日龄时,试验组胃质量显著大于对照组(P<0.05),胃和十二指肠黏膜绒毛显著高于对照组(P<0.05).     

猪传染性胃肠炎临床诊断及防治

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的急性高度接触性肠道传染病,临床上以腹泻、呕吐和脱水为特征,各种年龄的猪都可发病,对哺乳仔猪的危害最严重.然而以腹泻为主症的还有猪痢疾、仔猪黄痢、仔猪白痢、仔猪红痢(梭菌性肠炎)、流行性腹泻、轮状病毒感染、仔猪副伤寒等7种疫病,为了更有效地防控猪传染性胃肠炎,做到早诊断、早治疗.论文阐述了猪传染性胃肠炎与猪其他7种腹泻疫病的临床症状的区别及猪传染性胃肠炎的防治要点.