猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

酸性硫酸钙对临床常见致病微生物的杀灭能力

【目的】研究消毒剂酸性硫酸钙（ACS）对微生物的杀灭效果,为用消毒剂防控人畜疫病提供基础数据和理论依据。【方法】将ACS与中和剂（3%卵磷脂、5%吐温-80的磷酸盐缓冲液）共孵育一段时间后,再分别加入大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）共培养一段时间,将与细菌的混合物涂布于营养琼脂平板,置于37℃生化培养箱培养18—24 h;将与病毒的混合物接种于细胞板,在37℃细胞培养箱内培养一定时间,评价中和剂的中和效果。其对照设置和评判标准如下：消毒剂+菌悬液或病毒悬液（第1组）,（消毒剂+菌悬液或病毒悬液）+中和剂（第2组）,（中和剂+消毒剂）+菌悬液或病毒悬液（第3组）,（无菌硬水+菌悬液或病毒悬液）+中和剂（第4组）,（无菌硬水+菌悬液或病毒悬液）+PBS（第5组）,无菌硬水+PBS（第6组）;细菌杀灭试验中和剂效果评价标准：第1组有极少量细菌生长或无菌生长,第2组有菌生长且明显少于第3、4、5组但多于第1组,第3、4、5组细菌数接近且与阳性对照组细菌数接近,第6组无菌生长,3次重复试验均符合上述条件,结果一致,判定所选中和剂及浓度合适;病毒灭活试验中和剂效果评价标准：第1组有极少量病毒生长或无病毒生长,第2组有病毒生长且明显少于第3、4、5组但多于第1组,第3、4、5组病毒生长与原接种量相近,第6组细胞正常生长,3次重复试验结果一致,判定所选中和剂及浓度合适。利用悬液定量杀菌法和测定病毒滴度的方法评价ACS对上述细菌和病毒的消灭效果,将ACS 稀释200、300、400、500、600、700倍分别与上述细菌或病毒作用不同时间后加入中和剂进行中和,然后将细菌混合物涂布于营养琼脂平板,通过计算菌落数评价ACS杀灭细菌的效果,测定病毒混合物中病毒滴度评价ACS对病毒的杀灭效果。【结果】所选用的中和剂能够有效地中和ACS 200倍稀释液对细菌和病毒的残留作用,且该中和剂对细菌、病毒和细胞无毒性。当ACS与细菌作用0 h后立即被中和,最大稀释300倍对大肠杆菌的灭菌率为100%,最大稀释600倍对金黄色葡萄球菌的灭菌率为100%,最大稀释700倍时对沙门氏菌的灭菌率为100%。当ACS 稀释至700倍时,分别与上述细菌作用1d或6d后被中和,灭菌率均为100%;此外,ACS稀释200倍时,与PRRSV作用60 min后被中和,未检测出病毒滴度。【结论】ACS稀释700倍与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌作用1 d或1 d以上均能产生较好的杀灭效果;ACS稀释200倍与PRRSV作用60 min能完全杀灭病毒。这可为养殖场选用消毒剂防控疫病提供参考。