猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea，PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病，主要危害1周龄以内的仔猪，仔猪感染死亡率高达100%，是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白，将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼，第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞，提取淋巴细胞RNA，反转录得到cDNA，通过巢式PCR扩增VHH片段，并构建至pCANTAB-5E载体中，电转化至TG1感受态细胞，得到VHH噬菌体抗体展示文库；随后，对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集，利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体，通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白，经4次免疫后，双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷，阳性率85%；对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后，最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体，ELISA结果显示，6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合，表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体，所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗，同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。

Screening and Identification of Nanobodies against Porcine Epidemic Diarrhea Virus S Protein