携带BCoV抗原表位的乙型肝炎病毒核心抗原病毒样颗粒的制备及免疫效果评价

为了制备可用于牛冠状病毒(BCoV)亚单位疫苗的含BCoV S蛋白抗原表位的病毒样颗粒(VLP)，本研究将BCoV S1和S2蛋白中含B细胞表位的aa351～aa403 (159 bp)和aa771～aa784 (42 bp)对应的密码子按大肠杆菌偏好性原则优化后插入乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)主要免疫显性区域(MIR)，合成该重组基因后克隆至pET-32a(+)，经酶切鉴定显示正确构建了重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-BCoV S1+S2。将该重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)和伴侣感受态细胞BL21(DE3)(含pG-KJE8分子伴侣质粒)，经诱导表达后采用镍柱亲和层析法纯化两种不同表达形式的重组蛋白，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达及纯化效果，结果显示两种表达系统均正确表达了重组蛋白，分别命名为VLP-A、VLP-B，前者为包涵体表达，后者为可溶性表达。纯化后浓度分别为0.9 mg/mL、1.4 mg/m L。利用透射电镜观察纯化后的两种重组蛋白是否形成VLP，结果显示二者均形成VLP，且可溶性表达的重组蛋白形成的VLP产量略高。将两种VLP乳化后...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位区基因克隆、分析及原核表达

从患流行性腹泻的病猪小肠中分离猪流行性腹泻病毒(PEDV),设计一对引物用于扩增PEDV S蛋白的抗原表位区,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a,构建了重组表达质粒pET32a-PEDV-S1;在IPTG的诱导下表达,经SDS-PAGE分析,Western blotting鉴定,结果表明该抗原表位区蛋白得到了重组表达.该研究可为PEDV抗原表位区的相关研究提供参考.     

猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白gD主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本试验通过PCR方法以猪伪狂犬病病毒SD株的基因组DNA为模板扩增得到了含gD主要抗原表位编码区的片段,将该PCR产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游。构建的重组质粒pET-gD经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量约为45.2 ku,主要以包涵体形式存在。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该纯化蛋白能与猪伪狂犬病病毒抗体阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原反应性,可以作为猪血清伪狂犬病病毒抗体诊断用抗原。     

传染性法氏囊病病毒抗原表位与乙型肝炎病毒核心抗原嵌合基因的构建及其表达产物分析

为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位基因5epis的免疫效力,本研究应用重叠延伸PCR技术,在乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的231位～232位核苷酸(77位～78位氨基酸残基)之间插入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,构建基于HBcAg修饰基因(mHBc)的抗原表位嵌合体基因分子载体pET-mHBc。将编码IBDV多表位基因5epis定向插入到pET-mHBc的mHBc基因中,获得嵌合体基因mHBc-5epis表达重组质粒pET-mHBc-5epis,并在大肠杆菌中表达。经SDS-PAGE分析,重组嵌合体蛋白的分子量约29 ku,表达量约占菌体总蛋白的47.6%;Western blot结果表明,重组嵌合体蛋白可与IBDV抗体反应形成1条特异性蛋白带;重组嵌合体蛋白呈病毒样颗粒(VLP),直径约100 nm～120 nm;用IBDV抗体夹心ELISA检测,抗原效价达到1∶200。本实验成功构建了5epis与HBcAg嵌合体基因,并在大肠杆菌中高效表达,具有IBDV抗原反应性的重组病毒样颗粒嵌合体蛋白,为研究其表位型基因工程疫苗提供了新途径。     

猪瘟病毒E2蛋白抗原表位的表达与免疫活性研究

以猪瘟病毒全长基因组质粒为模板,PCR扩增出E2囊膜糖蛋白上A/D抗原区B细胞表位878aa～938aa;PCR扩增片段连接到pET-32a( )载体构建pET-AD原核表达质粒,将阳性质粒转化到BL21大肠埃希菌中诱导表达,以Ni-NTA亲和柱纯化,纯化后的蛋白进行Western blot鉴定。结果表明,重组质粒pET-AD在BL21大肠埃希菌中可以高效表达,表达的蛋白质经纯化后仍然有反应原性。     

伪狂犬病病毒gB蛋白抗原表位基因串联构建及原核表达

本试验通过自行设计两段引物,利用重叠延伸PCR方法,将伪狂犬病病毒(PRV)gB基因两段优势抗原表位序列串联,克隆至pMD18-T载体,测序正确后双酶切连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒;重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白表达情况。经检测,诱导后的重组蛋白获得表达,重组蛋白大小约为54ku,其中串联蛋白大小约为34ku。该重组蛋白可与伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体发生特异性反应,表明重组蛋白的抗原性良好。     

猪细小病毒结构蛋白VP2主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本文参照GenBank发表的猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,设计一对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原表位编码区的片段,产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-VP2经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量为39.1KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析,表达量约占菌体蛋白的65.2%。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该种蛋白能与阳性血清发生特异性反应。结果说明,该重组蛋白具有抗原性,可以作为鉴别诊断用抗原。     

副猪嗜血杆菌OmpA抗原表位预测、克隆及表达

运用生物信息学软件DNAStar对副猪嗜血杆菌S4型OmpA的二级结构、表面特性及抗原表位等进行分析，联合重组抗原表位基因片段，并对其进行密码子改造，人工合成改造后的基因片段。将其插入pET-32a构建重组表达载体pETpA，转化大肠杆菌BL21（DE3），进行诱导表达、鉴定及纯化。结果显示，OmpA胞外段的抗原表位分布于40～61、94～108、138～148、193～214氨基酸残基。重组后的表位基因序列与理论设计序列完全一致，表达产物为28000大小的融合蛋白且其能与兔抗Hpss4型多抗血清特异性地反应。融合蛋白经过柱纯化并经脱盐处理后质量浓度为4～40g／L。结果表明，成功构建表达OmpA多抗原表位的重组质粒pET—pA，并对融合蛋白进行分离纯化，为单克隆抗体的制备、检测方法的建立及疫苗的研制奠定了基础。     

新城疫病毒F蛋白抗原表位串联基因的构建及其原核表达

用自行设计的3对引物,通过RT-PCR从接毒的SPF鸡胚的尿囊液中克隆了新城疫病毒F基因3段抗原表位区段,大小分别为81、108、105bp。应用添加互补性酶切位点的基因工程方法,将3段抗原表位基因片段拼接成多表位串联基因,大小为306bp。将此基因片段插入含组氨酸(His)基因的质粒pET-32-a中,构建了重组质粒pET-32-a-F306。经诱导表达,获得相对分子质量约为31000的融合蛋白,其中F蛋白抗原表位串联基因片段表达产物约为11000。经亲和层析,获得纯化His-F306融合蛋白,进一步用该蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗新城疫病毒F蛋白抗体。经过琼扩、ELISA及Western-blot检测,表明该融合蛋白中的抗原表位串联基因所表达的蛋白具有良好的抗原性。     

猪流行性腹泻病毒M和S蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白和S蛋白基因的亲水区进行扩增,扩增片段(命名为Ma和Sa)分别克隆至原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。表达产物经SDS-PAGE后切胶免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清效价,Westernblot和间接免疫荧光方法检测抗体的特异性。结果表明目标蛋白获得了正确表达,且制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。PEDV Ma和Sa蛋白的表达及多克隆抗体的制备将为进一步构建PEDV的病毒样颗粒(VLP)抗原和建立血清学检测方法奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析

本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段（S2A）,将其克隆后插入原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1：32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。     

猪脑心肌炎病毒GXLC株VP1基因的原核表达及鉴定

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株的基因组序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增EMCV VPl基因目的片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了EMCV VPl基因重组表达质粒pET-32a-VP1.将pET-32a-VP1转化BL21(DE3)株感受态细胞,并用IPTG进行诱导表达.结...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】 探索猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV） S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】 以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a （+）原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验（IFA）检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】 成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-S重组蛋白的原核表达质粒和在HEK293T细胞中高效表达S1蛋白的真核表达质粒;PEDV-S重组蛋白在IPTG为0.5 mmol/L、16 ℃诱导8 h条件下可获得最高表达量,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,PEDV-S重组蛋白成功表达;ELISA检测结果显示,制备的多克隆抗体效价达1：3 280 500;IFA结果显示,多克隆抗体有良好的特异性,可特异性识别PEDV-S和PEDV-S1蛋白。【结论】 本研究获得了PEDV-S重组蛋白,并成功表达S1蛋白,制备出PEDV-S蛋白多克隆抗体,为研究S蛋白的结构和功能提供了条件,为揭示PEDV致病机制奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S基因与SEA基因融合表达及免疫原性评价

试验旨在构建pET-28a-S-SEA融合表达质粒,并评价S-SEA蛋白的免疫原性。根据大肠杆菌密码子偏嗜性,对我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株(GenBank:LT906620.1)的S基因与金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因(GenBank:MH053151.1)进行优化,通过柔性连接肽(GGGGS)连接后,克隆至表达载体pET-28a,得到pET-28a-S-SEA重组质粒,转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测后,对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,将亲和层析后的重组蛋白,免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,对免疫小鼠的血清特异性抗体水平和淋巴细胞增殖指数进行检测。结果成功构建pET-28a-S-SEA质粒,且在大肠杆菌中获得高效表达;小鼠试验结果表明,纯化的S-SEA蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,促进淋巴细胞增殖,具有良好的免疫原性,为进一步研究猪流行性腹泻亚单位疫苗提供帮助。     

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D 蛋白免疫 BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明, S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示, 腹水的抗体效价达到了1∶1 000 000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV) 5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与 PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究 PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。     

猪丁型冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

【目的】表达与纯化猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）的核衣壳（nucleocapsid,N）蛋白,并制备其多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb）。【方法】以PDCoV CHN-HN-1601分离株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增PDCoV全长的N基因编码序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a（+）中构建重组质粒pET-28a-PDCoV-N。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,利用0.5 mmol/L IPTG于37 ℃诱导表达12 h。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化N-端和C-端均携带6×His标签的重组N蛋白,并将其免疫新西兰白兔制备抗血清。利用Protein A/G琼脂糖树脂从免疫兔的抗血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）鉴定及抗体效价的间接ELISA测定。【结果】重组PDCoV-N蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量约为42 ku;上清可溶性N蛋白的纯化纯度可达90%、蛋白浓度为0.45 mg/mL;纯化后的多克隆抗体纯度较高,ELISA方法检测其效价为1∶6 400,能特异性地识别重组N蛋白和PDCoV,与可引起猪腹泻的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PRoV）无交叉反应。【结论】本研究成功制备重组PDCoV-N蛋白及其多克隆抗体,为后续深入研究N蛋白的功能、PDCoV优化血清学检测方法、免疫层析试纸条的制备及开展PDCoV相关基础研究提供参考。     

Prokaryotic Expression of Fusion Gene of Cat Recombinant Allergen Fel d 1 with Hepatitis B Core Antigen

To expose the cat recombinant allergen Fel d 1 protein on the outer surface of hepatitis B core antigen（HBcAg）virus-like particles（VLPs), the recombinant Fel d 1（rFel d 1）was created by linking the two genes chain 1 and chain 2 that composed the Fel d 1 protein. Then the rFel d 1 sequence was inserted into the HBcAg c/e1 loop area, replacing the amino acids between D78 and E83 in HBcAg c/e1 loop area. We successfully constructed the prokaryotic expression vector pET28a-HBcAg-rFel d 1 via gene codon optimization and synthesis. The recombinant plasmid pET28a-HBcAg-rFel d 1 was transformed into E.coli BL21(DE3）cells, then induced by IPTG, purified by Ni-NTA affinity chromatography and tested by SDS-PAGE, Western blotting and transmission electron microscopy（TEM). The fusion protein HBcAg-rFel d 1 was expressed successfully in E. coli expression system and the pure fusion protein HBcAg-rFel d 1 was purified by Ni-NTA affinity chromatography. Further, TEM confirmed the fusion protein HBcAg-rFel d 1 could assemble into VLPs. The fusion protein HBcAg-rFel d 1 could assemble into VLPs spontaneously, which laid a solid foundation for the research of the preventive and therapeutic vaccines for cat allergy.     

猪流行性腹泻病毒截短M基因克隆、生物信息学分析及其截短片段表达

【目的】 探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)截短M蛋白的序列结构特征与原核表达情况。【方法】 根据已公布的PEDV M基因序列设计1对特异性引物,以从阳性病料提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增并克隆PEDV截短的M基因(rM),应用在线生物信息学软件预测rM蛋白的结构特征。将得到的截短的M基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET-28a-rM,将鉴定正确的pET-28a-rM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功构建重组菌株BL21(pET-28a-rM),并对重组菌株进行IPTG诱导表达,优化重组蛋白的表达条件,重组蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE及Western blotting检测,同时应用重组蛋白制备兔抗rM多克隆抗体。【结果】 试验克隆得到大小为366 bp的截短的M基因,重组蛋白由121个氨基酸组成,预测蛋白分子质量大小约为12.8 ku。该蛋白的二级结构由无规则卷曲、延伸链、β-转角和α-螺旋组成,占比分别为48.76%、33.88%、9.09%和8.26%。该蛋白不含信号肽,但有跨膜区,包含21个磷酸化位点。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白大小约为15 ku,以包涵体蛋白形式存在,在37 ℃、1 mmol/L IPTG诱导12 h时蛋白的表达量最高。Western blotting检测结果表明,重组蛋白与PEDV阳性血清具有较好的反应原性,纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得的高免血清效价高于1∶51 200。【结论】 本研究成功克隆PEDV 截短的M基因,对rM蛋白进行了生物信息学分析,获得了高纯度的rM蛋白,为猪流行性腹泻治疗及检测用生物制品的开发奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。