猪囊虫病基因工程疫苗的生产工艺研究

从重组抗原的表达、复性与纯化、疫苗的配制及疫苗的质量控制等４个方面对猪囊虫病基因工程疫苗的生产工艺进行了探索。确定重组抗原表达的最佳培养液为ＬＢ磷酸盐培养液，诱导剂为１０ｇ／Ｌ乳糖，并根据接种量，溶解氧、罐压、发酵时间等对发酵结果的影响，确定了发酵培养的最佳条件。在重组抗原的复性与纯化方面，工程菌的裂解条件为选用溶菌酶感作用再超声波破菌，超声强度为２４０Ｗ５次，包涵体的纯化先采用低浓度的尿素洗涤２     

应用ELISA双抗体夹心法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究

本试验建立了检测鸡病毒性关节炎病毒的ELISA双抗体夹心法.取代反应、阻断试验均为阴性,与NDV、MDV和IBDV无交叉反应,对已知阳性标本的检测均为阳性;其敏感性比琼扩试验高80倍以上,这表明ELISA夹心法具有较高的特异性和敏感性.在人工感染后2～27d,关节滑膜、腱鞘和脾脏中病毒检出率为100％;还从肝脏、法氏囊和脑组织中检测到病毒.     

猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建与筛选

在体外将猪带绦虫虫卵孵化为有活力的六钩蚴。采用商品化试剂盒抽提六钩蚴总 RNA、m RNA,反转录为双链c DNA,再加 Eco R Adapter。在去除小片段后 ,dsc DNA与 λgt11噬菌体 DNA连接 ,经蛋白包装 ,构建了猪带绦虫六钩蚴λgt11c DNA文库。该文库效价为 3.5× 10 9pfu/ m L ,重组 DNA片段大小为 0 .5～ 3.2 kb,平均为 1.6 kb,蓝白斑比 1∶ 9。用抗体探针对文库进行免疫学筛选 ,在消除非特异性反应的基础上筛选约 10 6 重组子 ,共得到 118株强阳性克隆 ;应用 PCR鉴定上述部分阳性克隆 ,均扩增到 0 .5 kb以上的片段。结果显示 ,构建的文库合格 ,含六钩蚴所有抗原基因 ,可用于六钩蚴 c DNA克隆的筛选 ;用免疫学与 PCR联合筛选 c DNA文库 ,可消除假阳性     

应用免疫酶染色法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究

用免疫酶染色法检测Ｖｅｒｏ细胞培养物、陈旧石蜡切片和人工感染试验鸡组织中的ＡＶＡＶ，并比较了ＡＶＡＶ强毒和弱毒株在组织中的分布情况。结果发现，试验鸡于感染ＡＶＡＶ弱毒株后１～５天、感染ＡＶＡＶ强毒株后１～９天出现病毒血症；跗关节、跖趾关节、趾关节、趾屈肌健、脾脏、肝脏等组织中病毒的检出率最高，存在时间也最长；在感染后３～２０天于感染鸡法氏囊、感染后３～１１天于感染鸡胸腺中检出了强毒株，在这两组织中未检出ＡＶＡＶ弱毒株。感染８小时后的Ｖｅｒｏ细胞培养物和陈旧石蜡切片均被检出ＡＶＡＶ。     

应用免疫酶染色法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究

用免疫酶染色法检测Ｖｅｒｏ细胞培养物，陈旧石蜡切片和人工感染试验鸡组织中的ＡＶＡＶ，并比较了ＡＶＡＶ强毒和弱毒株在组织中情况，结果发现，试验鸡于感染ＡＶＡＶ弱毒株后１－５天、感染ＡＶＡＶ强毒株后１－９天出现病毒血症；跗关节、跖趾关节、趾关节，趾屈肌健、脾脏、肝脏等组织中病毒的检出最高，存在时间也最长；在感染后３－２０天于感染鸡法氏囊、感染后３－１１天于感染鸡胸腺中检出了强毒株，在这两组织中未检出Ａ     

鸡病毒性关节炎病毒的提纯结构蛋白及其免疫活性分析

采用差速离心和蔗糖递度超速离心法提纯了鸡病毒性关节为病毒（ＡＶＡＶ）９３０７株，并用ＳＤＳ－ＰＡＧ电泳技术分析其结构蛋白，该病毒主要由８条多肽组成（ＶＰ１～ＶＰ８），它们的分子量分别是１４５，１３０，１１５，７２，７０，６５，４２，３９ＫＤ。用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹技术分析这些多肽的免疫活性，与同源病毒株抗血清出现５条可见的反应带，分别是ＶＰ１，ＶＰ２，ＶＰ４，ＶＰ５和ＶＰ７；与异     

基因芯片技术在钩端螺旋体病传染源监测中的应用

为了将合成的核酸探针点样到玻片 上制备成基因芯片,先用常规PCR扩增动物 组织中钩端螺旋体特异片段,再用Cy3标记 引物,通过不对称PCR获取荧光素标记的靶 序列,然后与制备的芯片杂交,扫描仪记录结 果。同时,以PCR技术为对照,进一步观察 基因芯片技术检测动物传染源中钩端螺旋体 的特异性、敏感性及可行性。常规PCR扩增 问号钩端螺旋体阳性标本,出现单一482bp 的扩增产物,而双曲钩端螺旋体及其他螺旋 体、病原、正常动物组织均无任何DNA扩增 条带,芯片杂交结果与常规PCR方法结果一 致。用芯片和PCR对动物组织中不同浓度 钩端螺旋体的检测,最低检测浓度分别为10 条和100条钩端螺旋体,芯片检测的敏感性 高于常规PCR法。用基因芯片与PCR分别 对标本进行检测,5只人工感染的豚鼠肾、 肝、心、血等组织的检测结果均为阳性;28份 疫区野鼠肾标本阳性结果分别为8份和4 份,10份可疑病猪肾标本阳性结果分别7份 和5份;5份非疫区野鼠肾、5份正常猪肾标 本以及其他微生物的检测结果均为阴性。结 果表明,基因芯片技术可快速、灵敏、特异地 检测动物传染源中问号钩端螺旋体。     

金免疫层析法检测囊虫循环抗原试验研究

应用胶体金和免疫层析技术进行了检测金免疫层析法(GICA)囊虫循环抗原(CA)试验研究。5株抗囊虫McAb和一株多抗用于最佳配对的筛选,一株用于标记胶体金,另一株包被NC膜。以双抗体夹心ELISA为对照,GICA用于CA检测,观察其敏感性、特异性和稳定性。结果显示,以McAb 1A5和1B6配对的结果最佳,1A5最适标记量为10μg／mL,186最佳包被浓度为1 g／L;用GICA和ELISA两种方法检测囊虫CA,痈猪血清和囊液的符合率达100％,病人血清和脑脊液的符合率达80％;CA最低检测量为10 ng,检测正常猪、人及其他疾病血清,均呈阴性;检测时间5-15 min,整个实验仅一步操作;GICA试纸条分别在4℃和室温下保存105 d以及在37℃保存45 d,检测结果均未发现改变。以上结果表明,快速检测囊虫循环抗原的金免疫层析法具有简便、快速、敏感、特异和稳定的特点,适合基层使用。     

鸡病毒性关节炎病毒适应Vero细胞的研究

５株已适应鸡胚细胞的ＡＶＡＶ在Ｖｅｒｏ细胞上传２－５代后；备