应用CSFV-E2基因噬菌体肽库筛选猪瘟病毒抗原表位

采用猪瘟单抗对猪瘟病毒石门株E2基因噬菌体随机肽库(SM-E2库)进行淘洗以研究猪瘟病毒E2抗原表位.运用猪瘟单克隆抗体WH303、WH211和M56对SM-E2库进行4轮生物淘洗,对阳性克隆再经噬菌体原位杂交、特异PCR测序分析,然后人工合成阳性多肽进行ELISA反应.经鉴定分析发现单抗WH303从SM-E2库中筛选得到一段CSFV特异的抗原多肽IECTAVSPTTLRTEVVKT,并且该段多肽与已知CSFV表位TAVSPTTLR极为相似;单抗WH211和M56未能筛选到包含CSFV序列的克隆.结果表明,利用靶基因噬菌体随机多肽库筛选抗原表位能够得到更接近于真实表位的抗原表位.     

猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析

以猪流行性腹泻病毒（PEDV）可溶性的猪氨基肽酶N受体为靶蛋白对PEDV S1基因特异性肽库进行3轮生物淘选,然后对30个淘选的噬菌体克隆进行测序。序列分析发现,2个噬菌体克隆展示无义氨基酸序列,其余28个噬菌体克隆展示的氨基酸序列位于PEDV S蛋白的第249-529位氨基酸区域,这个区域被命名为MRR。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对MRR基因进行真核表达。Western blot结果表明,表达的MRR重组蛋白能够与兔抗PEDV多克隆抗体反应。     

传染性腔上囊病病毒VP3蛋白模拟表位的筛选

为了研究传染性腔上囊病病毒（IBDV）的致病机理及研制有效的IBDV疫苗，利用噬菌体展示技术对IBDV VP3抗原表位进行了筛选。以4株IBDV VP3单克隆抗体HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E作为筛选分子，对噬菌体随机15肽库进行3轮吸附-洗脱-扩增淘洗，从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取20个单克隆噬菌斑，通过间接ELISA和竞争抑制ELISA检测，共选出13个单克隆噬菌斑，经噬菌体gⅢ部分基因的核苷酸序列测定，确定了8个15肽为IBDV抗原表位。这8个15肽在一级结构上没有3个以上连续氨基酸与IBDV GX（Gen—Bank登录号：AY444873）VP3的氨基酸序列相同，但二级结构上均以β折叠为主，并且与单抗的结合可被VP3蛋白有效地抑制。证实，筛选的是IBDV VP3的模拟表位。     

猪瘟病毒保护性抗原E2蛋白单抗的制备及其抗原表位的初步分析

应用大肠杆菌表达的猪瘟病毒主要保护性 E2抗原决定簇蛋白和全长 E2基因构建的 DNA疫苗免疫 BAL B/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与 SP2 /0骨髓瘤细胞进行融合 ,经克隆和间接 EL ISA筛选 ,获得了 A11、B2、E3、H6、D5、D86株稳定分泌抗猪瘟病毒 E2蛋白单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞株。它们的腹水效价在 1∶ 80 0～ 1∶ 2 10 0 0 0之间。抗体类型鉴定结果表明 ,A11、E3、H6、D5和 D8为 Ig M类型 ,B2为 Ig G类型。随后用蛋白 A凝胶层析法和 PEG沉淀法分别纯化了 Ig G和 Ig M单抗。对纯化单抗进行的抗原识别表位研究结果初步表明 ,6株单抗可能识别 3种不同的E2抗原表位。     

猪瘟病毒E2糖蛋白A1抗原亚区的表达

猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。E2存在4个不同抗原区(A-D)，根据中和特性和保守性差异，将A抗原区进一步划分为A1、A2、A3抗原亚区，A1抗原亚区在不同猪瘟病毒分离毒株中高度保守且诱导的单克隆抗体具有中和特性。本采用pRSET C载体，对A抗原区2744nt～2947nt(791aa～858aa)基因片段(EC)进行克隆、表达，并分析表达产物的免疫反应性。研究发现：EC表达产物能与抗猪瘟病毒Alfort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2410发生特异性结合，且此结合能被猪瘟病毒抗原或阳性血清阻断。结果表明：A1抗原亚区位于E2蛋白791～858位氨基酸区域。     

猪瘟病毒E2糖蛋白A1亚区抗原性分析

采用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统，对猪瘟病毒A抗原区内的2744-2947nt基因片段(EC)进行了克隆、表达，并分析了表达产物的抗原性。研究发现，EC表达产物能与抗猪瘟病毒Alfort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2410、a18发生特异性结合，且用其免疫动物后能诱导机体产生中和抗体。结果表明，A1抗原亚区位于E2蛋白791～858位氨基酸区域。     

鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定及其表位交叉反应性分析

为鉴定鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白的抗原表位,本研究以纯化的抗DTMUV E蛋白单克隆抗体(MAb)3B6为固相筛选分子,对噬菌体随机12肽库进行淘选,通过对阳性噬菌体克隆测序分析,确定DTMUV E蛋白的模拟表位氨基酸序列,将模拟表位序列与GST蛋白融合表达并进行western blot验证。利用DNAStar对表位序列进行同源性分析,并通过dot blotting方法分析抗原表位在黄病毒阳性血清间的交叉反应性。结果鉴定了DTMUV E蛋白的一个线性抗原表位EVEPPFG,并且该表位在DTMUV与其它黄病毒中均具有高度的保守性。Dot blotting结果显示抗原表位EVEPPFG在黄病毒阳性血清间具有交叉反应性。因此,EVEPPFG为黄病毒共享型的抗原表位,这对于黄病毒E蛋白的抗原结构功能的研究以及研制表位疫苗和诊断抗原等具有重要意义。     

细胞源猪瘟活疫苗E2基因遗传稳定性和免疫原性分析

测定了中国4个细胞源猪瘟活疫苗(C株)E2基因全序列,将其与GenBank上13个猪瘟病毒的E2基因序列(含C株原始毒株、7个猪瘟病毒C株以及国际上5个主要猪瘟活疫苗毒株的E2基因全序列)进行了核苷酸序列、推导的氨基酸序列进行遗传变异分析,通过生物信息学手段对预测的E2蛋白N-糖基化位点、E2蛋白磷酸化位点和理化特性以及模拟的蛋白空间结构进行了比较,并通过免疫攻毒试验对4个细胞源猪瘟疫苗(C株)的免疫效果进行了验证。结果表明,与猪瘟病毒C株原始种毒相比,尽管中国4个细胞源猪瘟活疫苗的E2基因核苷酸序列、推导的E2蛋白氨基酸序列或模拟的三维结构等发生个别核苷酸变异、个别氨基酸位点突变或缺失,但均不影响猪瘟C株的免疫原性,猪瘟疫苗C株仍然是防控猪瘟的最有效武器。     

CSFV囊膜蛋白E2单克隆抗体识别表(拟)位基序的差异性分析

CSFV囊膜糖蛋白E2是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白.本研究应用抗CSFV(Alfort毒株)E2蛋白的单克隆抗体c2410、WH303及M1669,筛选噬菌体展示的12肽随机肽库,进行表位分析.结果发现:c2410、WH303针对同一线性表位,精确定位于E2蛋白的832～837位氨基酸SPTTLR,是CSFV特异性表位.同时发现WH303识别的2个主要拟位基序:(W)NKPxT、AxWPTA,M1669识别的3个主要拟位基序:DxMRLD、(SL)MPPF、MLLHxxPxL,但在E2蛋白中均未查找到与之相同(似)序列.应用ELISA、竞争性ELISA、免疫印迹分析不同表(拟)位对单克隆抗体的免疫反应性差异,结果发现:(1)c2410对WH303的3个噬菌体拟位(WNKPxT,AxWPxATA,SPSxLR)在ELISA、免疫印迹检测中均为阴性;(2)SPTxLR噬菌体拟位能与c2410、WH303发生特异性结合,且此结合能被病毒抗原阻断;(3)M1669的3个噬菌体拟位(DxMRLD,(SL)MPPF、MLLHxxPxL)在ELISA、免疫印迹中能与M1669发生特异性结合,但此结合不能被病毒抗原阻断.     

蓝舌病1型病毒VP7蛋白表(拟)位定位及免疫检测分析

为研究蓝舌病1型病毒VP7蛋白关键性氨基酸表位定位,本试验应用抗蓝舌病1型病毒VP7蛋白单克隆抗体淘选噬菌体展示的7肽随机肽库,对筛选的共有序列噬菌体扩增纯化,通过ELISA、竞争性ELISA分析共有噬菌体拟位与蓝舌1型病毒VP7蛋白单克隆抗体的免疫反应性。结果表明,含有LNWPMVR基序的噬菌体拟位能够与蓝舌病1型病毒VP7蛋白单克隆抗体发生特异性结合,并且此结合能被蓝舌病1型病毒抑制或阻断,表明噬菌体7肽模拟了BTV蛋白上与蓝舌病1型病毒VP7蛋白单克隆抗体结合的抗原决定簇,提示蓝舌病病毒VP7蛋白的第163-189位氨基酸（LNAGARGDVQQIFQGRNDPMMIYLVWR）构成蓝舌病病毒VP7蛋白特异性表位。     

A novel dendrimeric peptide induces high level neutralizing antibodies against classical swine fever virus in rabbits

The amino acid sequence (TAVSPTTLR, 829-837aa) on the glycoprotein E2 of classical swine fever virus (CSFV) is a conserved and linear neutralizing epitope. In the present study, two peptides were constructed based the core sequence of this neutralizing epitope, the dendrimeric peptide (Th-B(4)) containing four copies of B cell epitope fused to one copy of promiscuous T helper (Th) cell epitope and the peptide Th-B containing a single copy of B cell epitope fused to one copy of Th cell epitope. The dendrimeric peptide Th-B(4) elicited high titers of neutralizing antibodies as detected in an indirect ELISA, blocking ELISA and neutralization test and induced a complete protection against CSFV C strain in rabbits. The Th-B elicited low titers of neutralizing antibodies and did not induce a protection in rabbits. These results suggest that the dendrimeric peptide Th-B(4) may be a promising marker vaccine candidate against CSFV and the multimerization is a requirement for development of a peptide vaccine.     

应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位

以抗兔出血症病毒(RHDV)的单克隆抗体A3c作为靶物质,应用噬菌体展示技术筛选RHDV抗原表位。将纯化的单抗A3c包被固相载体,经3轮亲和筛选后,挑取25株噬菌体单克隆并扩增,用ELISA测定后,提取阳性克隆单链DNA并测序,用阳性噬菌体克隆免疫小鼠制备高免血清,检测筛选抗原表位的免疫原性。结果表明:3轮亲和筛选后,特异性噬菌体克隆得到了有效富集,25株噬菌体单克隆中有19株为阳性克隆;测序结果表明,获得了与抗原高度同源的序列GTDDMDPGTTAA,即抗原的模拟表位,其中,氨基酸基序DXXDP为表位中的核心氨基酸;制备的小鼠高免血清与抗原具有较好的反应性,阳性噬菌体克隆与兔RHDV高免血清也具有较好的反应性。因此,该表位具有良好的免疫原性和反应原性。该研究为RHDV抗原表位的研究和新型疫苗的探索积累了资料。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株致弱毒株特异性抗原表位的鉴定

通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virtls,Hp-PRRSV）HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2（Nonstnduralprotein2）蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2蛋白存在4处氨基酸点突变,针对每个突变点分别人工合成编码短肽的核苷酸序列,经原核表达后进行Western blot分析。结果表明表达的融合蛋白F65-11（^749KGEPvsdqpak^759）能够特异性的与HuN4-F40、HuN4-F65和HuN4-F112感染猪的血清发生反应,而与HuN4 F5感染猪的阳性血清和CH-1a株阳性血清不发生反应,证实第4个氨基酸点突变（S754）处存在一个免疫优势抗原表位。将该表位肽段由N端和C端逐步缩短继续鉴定,当N端缩短到第5个氨基酸（^754SDQPAK^759）C端缩短到第3个氨基酸（^749KGEPVSDQ^757）时,表达的融合蛋白不能与PRRSV阳性血清反应,最终推测该抗原表位必需氨基酸为^753VSDQ^756。选取GenBank中提交的部分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp2氨基酸序列,对该表位氨基酸所在位置进行序列比较,分析结果显示位于Nsp2蛋白749→759位氨基酸序列高度保守,F65—11变异位点C^754→7^754为HuN4株系列传代毒株所特有。本研究结果证实抗原表位F65—11可以作为鉴别HuN4-F112弱毒疫苗所诱导产生的特异性抗体的候选抗原。     

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT－nPCR方法，选择猪瘟病毒2000年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析，并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示，云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90％；但与中国标准强毒石门株差异较大，其核苷酸及氨基酸同源性均小于80％。     

禽流感病毒M1蛋白表(拟)位定位及免疫检测分析

为对禽流感病毒(AIV)M1蛋白表(拟)位进行分析,本研究采用针对AIV M1蛋白的型特异性单克隆抗体(MAb),淘选M13噬菌体展示的7肽随机肽库,进行M1蛋白表(拟)位分析。筛选获得共有序列MDRxL或HPR,定位于M1蛋白93～99位(93MDRAVKL99)和222～230位(222HPNSSAGLR230)氨基酸区域。采用ELISA、竞争性ELISA分析不同噬菌体拟位与抗M1的MAb免疫反应性,表明含有MDRxL或HPR基序的噬菌体拟位能够与MAb发生特异性结合,并且其结合能够被天然病毒抗原抑制或阻断,表明拟位多肽真实模拟病毒蛋白上与MAb结合的抗原决定簇或表位,提示M1蛋白93～99位(93MDRAVKL99)和222～230位(222HPNSSAGLR230)氨基酸区域构成AIV型特异性表位。     

从噬菌体随机十二肽库中筛选新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶模拟表位

以生物素标记的抗新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)的单抗M22为分子探针,从噬菌体随机12肽库中筛选鉴定该抗体所识别的抗原模拟表位.经过三轮亲和筛选,得到了四个能与单抗M22反应的阳性噬菌体单克隆,分别为CLONE 11、17、18、20.竞争ELISA试验表明,CLONE 20与M22的结合能被新城疫弱毒株La Sota特异性抑制,抑制率达67.3%.经测序,获得CLONE 20的插入序列为SWFHHHQARAPM,同源性分析认为WF和QAR在HN的抗原性中起重要作用.动物试验结果表明,CLONE 20能诱导SPF鸡产生一定水平的具有血凝抑制活性的特异抗体.以上结果显示SWFHHHQARAPM是具有免疫原性的HN抗原模拟表位.     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列.设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证.经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性.对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体.本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据.     

Identification of antigenic epitopes of the SapA protein of Campylobacter fetus using a phage display peptide library

In this study, we immunized mice with prokaryotically expressed recombinant surface layer protein, SapA, of Campylobacter fetus, generated hybridomas secreting mouse monoclonal antibodies (mAb) targeting SapA, and purified the mAb A2D5 from mouse ascites using saturated ammonium sulfate solution. The mAb A2D5, coated onto ELISA plates, was used to screen the phage random 12-peptide library through three rounds of panning. Following panning, 15 phage clones were randomly chosen and tested for reactivity with mAb A2D5 by indirect ELISA. Single-stranded DNA from positive clones was sequenced and compared with the sequence of SapA to predict the key epitope. ELISA and/or Western blot analyses further validated that synthetic peptides and recombinant peptide mimotopes all interact with mAb A2D5. Nine of ten positive phage clones identified by screening were sequenced successfully. Seven clones shared the same sequence HYDRHNYHWWHT; one had the sequence LSKNLPLTALGN; and the final one had the sequence SGMKEPELRSYS. These three sequences shared high homology with SapA J05577 in the region GNEKDFVTKIYSIALGNTSDVDGINYW, in which the underlined amino acids may serve as key residues in the epitope. ELISA and/or Western blot analyses showed that mAb A2D5 not only interacted with the four synthetic peptide mimotopes, but also with 14 prokaryotically expressed recombinant peptide mimotopes. The mimotopes identified in this study will aid future studies into the pathological processes and immune mechanisms of the SapA protein of C. fetus.     

Identification of a conformational epitope on the VP1 G-H Loop of type Asia1 foot-and-mouth disease virus defined by a protective monoclonal antibody

Although neutralizing antigenic sites of foot-and-mouth disease virus (FMDV) can be defined by selection of monoclonal antibody (MAb) escape mutants, no conformational neutralizing epitope on the major antigenic site located on the G-H loop of type Asia1 FMDV has been precisely mapped. In this study, we generated a potent neutralizing MAb 3E11, which recognized a conformation-dependent epitope and neutralized FMDV Asia1/YS/CHA/05 in vitro. Importantly, a dose of 5.5 NT(50) of the MAb 3E11 completely protected suckling mice from a dose of 10 LD(50) of homologous virus challenge in vivo. Through a 12-mer random peptide phage display, synthetic peptide analysis and constructing a series of FMDV Asia1/YS/CHA/05 mutants using reverse genetic system, we finely mapped the neutralizing epitope as the 12-amino acid peptide (141)SXRGXLXXLXRR(152). These results provide additional insights into the virus-MAb interaction at the amino acid level and may help in the development of an epitope-based Asia1 FMDV vaccine.     

Identification of antigenic epitopes of the SapA protein of Campylobacter fetus using a phage display peptide library

In this study, we immunized mice with prokaryotically expressed recombinant surface layer protein, SapA, of Campylobacter fetus, generated hybridomas secreting mouse monoclonal antibodies (mAb) targeting SapA, and purified the mAb A2D5 from mouse ascites using saturated ammonium sulfate solution. The mAb A2D5, coated onto ELISA plates, was used to screen the phage random 12-peptide library through three rounds of panning. Following panning, 15 phage clones were randomly chosen and tested for reactivity with mAb A2D5 by indirect ELISA. Single-stranded DNA from positive clones was sequenced and compared with the sequence of SapA to predict the key epitope. ELISA and/or Western blot analyses further validated that synthetic peptides and recombinant peptide mimotopes all interact with mAb A2D5. Nine of ten positive phage clones identified by screening were sequenced successfully. Seven clones shared the same sequence HYDRHNYHWWHT; one had the sequence LSKNLPLTALGN; and the final one had the sequence SGMKEPELRSYS. These three sequences shared high homology with SapA J05577 in the region GNEKDFVTKIYSIALGNTSDVDGINYW, in which the underlined amino acids may serve as key residues in the epitope. ELISA and/or Western blot analyses showed that mAb A2D5 not only interacted with the four synthetic peptide mimotopes, but also with 14 prokaryotically expressed recombinant peptide mimotopes. The mimotopes identified in this study will aid future studies into the pathological processes and immune mechanisms of the SapA protein of C. fetus.