七种猪常见病毒核酸磁-纳米微粒可视化快速检测技术的建立与应用

随着集约化养殖业的发展，规模化养猪场对于病原的早期快速检测需求逐步增高，本研究旨在建立针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus, PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)和猪细小病病毒(porcine parvovirus, PPV)等7种常见病毒病病原感染的广谱磁纳米微粒可视化(ultrasensitive nanoparticle visualization detection, UNVs)现场检测技术。根据不同病毒的复制酶区域的高度保守区域，设计探针和引物，通过探针的筛选和条件的优化...     

2017—2019年华东地区猪场主要病毒性腹泻病原调查

本研究旨在了解当前我国华东地区引起猪腹泻的主要病毒性腹泻病原的流行情况，为该地区更好地开展猪腹泻病毒的防控工作提供临床数据。分别采用RT-PCR检测方法对2017—2019年华东地区35个场别594份临床样品检测猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪轮状病毒（porcine rotavirus，PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）、猪丁型冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）和猪萨佩罗病毒（porcine Sapelovirus，PSV）等5种猪的病毒性腹泻病原，并对其阳性率及混合感染情况进行统计分析。结果显示，2017—2019年的PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV及PSV的平均阳性率为分别为62.6%（372/594）、27.9%（166/594）、16.8%（100/594）、13.3%（79/594）及3.87%（23/594），二重混合感染中以PEDV+PDCoV及PEDV+PoRV为主，平均混合感染率分别为22.4%（133/594）和13.3%（79/594）。三重感染中以PEDV+PoRV+PDCoV混合感染为主，感染率为7.58%（45/594），未见四重及五重病原混合感染。2017—2019年PEDV平均阳性检出率最高，且常与PoRV及PDCoV发生混合感染，是当前华东地区猪病毒性腹泻类疫病的防控重点。TGEV和PDCoV在健康育肥猪及母猪的检出率中占比较大，表明隐性感染变得普遍，值得养殖户关注。除此之外，PSV的检出率远低于其他4种腹泻病毒。总之，随着2018年后养殖场加强生物安全防控措施和猪群管理，各病原检出率和阳性场检出率呈现逐年下降趋势。     

规模养猪场仔猪病毒性腹泻病原的分子检测

为了解保山市隆阳区规模养猪场仔猪病毒性腹泻的病原感染情况,应用RT-PCR或PCR方法对采自保山市隆阳区不同地方16家养猪场腹泻仔猪的肛门拭子样品进行了5种病毒性病原的检测。结果显示阳性检出率最高的为猪圆环病毒(PCV-2),16家猪场均检出阳性样品,阳性样品率最高达到100%,最低33.33%;其次为猪流行性腹泻病毒(PEDV),16家养猪场有4家猪场检出了PEDV阳性样品,占采样养殖场数的25.00%,阳性样品率分别为25.00%、33.33%、25.00%、20.00%。但此次所采样品中未检出猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)及猪瘟病毒(CSFV)3种病原,3种病原的阳性样品率都为0;检测的这93份样品中存在部分混合感染的情况。     

同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10³,1.13×10³,1.31×10²和1.18×10^2<...     

浙江省部分地区猪病毒性腹泻的流行病学调查

正猪病毒性腹泻是一类呈全国性散发流行的急性、接触性肠道传染病。临床上以引起仔猪水样腹泻、呕吐、脱水消瘦甚至死亡为典型症状,成年猪多不可见临床症状或仅有一过性软便。该病病原主要有猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(porcine     

PEDV、TGEV、PoRV 3种猪病毒性腹泻病毒的流行现状及控制策略

引起猪病毒性腹泻的病原主要有猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)及猪轮状病毒(porcine rotarvirus,PoRV),临床均以呕吐、严重腹泻和脱水为特征,哺乳仔猪发病率和病死率较高,后备猪、母猪或育肥猪呈一过性腹泻,发病率较低。特别是自2010年以来,PEDV变异毒株的流行已对全球的生猪产业造成严重影响,而已有的防控措施已经不能应对新的流行态势。近年来,针对PEDV、TGEV、PoRV的毒株流行变化及防控措施研究的较多,许多新技术、新方法已应用于3种病原的控制。作者基于当前3种病毒的遗传变异分析和流行现状,从饲养管理、免疫预防、中药疗法、干扰疗法、特异疗法及返饲疗法等方面对防控措施进行综述,以期为猪病毒性腹泻的防控提供科学依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立快速、简便且能同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验根据GenBank中已登录的PRRSV ORF7基因序列和PEDV N基因序列,设计2对特异性引物和2条TaqMan探针,通过优化扩增条件建立检测PRRSV和PEDV的双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,同时还进行了特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品检测。结果表明:最终确立的20μL扩增体系中各引物和探针的加样量分别为:PRRSV-F 0.8μL,PRRSV-R 0.6μL,PRRSV-P 0.5μL;PEDV-F 1.2μL,PEDV-R 1.0μL,PEDV-P 0.7μL。(优化后的最佳扩增程序为:50℃反转录6 min;95℃预变性1 min;95℃变性10 s,55℃退火10 s,72℃延伸10 s,共40个循环)。检测PRRSV和PEDV的敏感性可分别达到1.05 TCID_(50)/100μL和3.16 TCID_(50)/100μL,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,批内变异系数和批间变异系数均不高于2.0%。用该方法对234份临床样品进行检测,PRRSV阳性样品15份, PEDV阳性样品20份,检出率高于常规RT-PCR方法。说明试验建立的双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法敏感性高,特异性好,可同时准确、快速检测PRRSV和PEDV。     

预防猪流行性腹泻病毒间接传播的生物安全措施评估

正本研究采取了不同的生物安全措施利用可控的试验条件来评估由生物安全防护措施来减少猪流行性腹泻病毒(PEDV)传播的有效性,这些结果表明,通过污染的个人防护用品导致的PEDV间接传播较为迅速,在养猪生产体系实施生物安全防护措施,可以有效地降低猪群之间PEDV传播的风险。猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrheavirus,PED)是一种高度传染性疾病,可导致猪严重腹泻。猪流行性腹泻病毒(PEDV)可以在已     

10种猪常见病毒基因芯片检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种可同步检测猪10种常见疫病病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)、猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)和口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus,FMDV)的基因芯片检测技术,为临床病料的初步诊断及流行病学调查提供一个新的可靠方法。对10种病毒基因的序列进行分析,设计引物对靶基因进行PCR扩增,将纯化后的靶基因点制成芯片,通过Cy3标记特异性引物扩增病毒得到具有荧光标记的探针,然后与芯片进行杂交,扫描分析结果,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法和普通PCR/RT-PCR方法对1 006份样品进行符合检测。试验结果表明,基因芯片检测10种病毒特异性好、灵敏度高,最低检测限度可达10~(5 )copies·μL~(-1),检测中,基因芯片与普通PCR/RT-PCR对1 006份临床样品的检测符合率为96.79%以上。初步研究表明,该基因芯片技术可同时同步检测10种猪疫病病毒,可应用于临床病料的初步诊断。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、准确、常规的猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)检测方法,根据PHEV N蛋白基因序列,设计1对引物和1条探针,建立了PHEV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法特异性好,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应;用阳性质粒Puc57-PHEVn评估其敏感性,发现检测下限达10~(-6) ng/μL(224拷贝/μL)。采集233份发病猪组织样品进行临床检测,发现该方法与巢式RT-PCR的符合率达98.3%,准确筛查出巢式RT-PCR并测序阳性的样品14份,且检出率高于巢式RT-PCR。结果表明,本方法敏感、特异,可用于PHEV临床样品的检测。     

PEDV流行株重组截短N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的PEDV截短N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA。该抗原不与其他常见的7种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%;rnPED-ELISA相对于血清中和试验(SN)试验的敏感性为93.33%,特异性为90.00%;rnPED-ELISA与TSZ全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67%。采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为69.5%。本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可为免疫猪群抗体监测和猪流行性腹泻流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

2017—2021年广西腹泻猪群主要病毒性腹泻病原检测

为掌握广西地区导致猪群腹泻的主要病毒性病原的流行态势,为养殖场猪病毒性腹泻的综合防控提供依据,用实时荧光RT-PCR检测方法,对2017年1月—2021年6月广西14个地市489个猪场1 206份临床腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪丁型冠状病毒（PDCoV）等病原检测,并分析其阳性检出率在不同年份、季节、地区、年龄段猪群之间的差异以及病原混合感染情况。结果显示,2017—2021年,PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV样品阳性检出率分别为49.67%、7.63%、4.56%和0.33%,场阳性检出率分别为53.37%、8.18%、8.18%和0.61%;病毒性腹泻病原有一定的季节性流行特征,多表现为冬、春季流行加重;PEDV、PDCoV普遍流行,PoRV局部流行,TGEV散发流行;4种病原对不同年龄段腹泻猪群的感染率存在差异,其中对哺乳仔猪危害最为严重;猪群以单一感染为主,主要为PEDV单一感染,阳性检出率为47.93%,混合感染均为二重感染且感染率较低。结果表明,导致广西地区猪群腹泻的主要病毒性病原主要为PEDV、PDCoV和PoRV,其中PEDV为最主要病原,其他病原也呈流行加重趋势,需进一步加强病原监测和疫病综合防控。     

四川养猪场常见病毒性病原流行病学调查及疾病有效防控能力分析

为了解四川地区养猪场常见病毒性疾病感染情况,分析不同养猪场对疾病有效防控能力,进一步推测各猪场对新发和外来动物疫病的感染风险。研究采用高通量检测方法,对不同类型养猪场采集的426份临床样品进行病毒性病原流行病学调查,结果显示四川地区养猪场病毒性病原阳性检出率较高,普遍存在多病原混合感染情况,且较为严重,病原感染种类增多,且具有流行普遍性。其中以PCV2、PRRSV、PRV、PEDV的感染最为常见,特别是PCV2和PRRSV的混合感染,已经成为目前猪病中最为多发的病毒性疾病。猪场应进一步完善生物安全措施,做好猪群的饲养管理,结合现有疫苗控制和降低猪场疾病感染的可能。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为快速、准确、灵敏检测猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,以PEDV N基因为靶标设计引物,建立了一种PEDV SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。该方法最低可以检测到10个拷贝的病毒核酸,与猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪轮状病毒等胃肠道病毒均无交叉反应,批内、批间重复试验的变异系数均在2%以内,表明该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。运用该方法对2018—2019年采集自山东省不同地区猪场的161份临床样品进行检测,检测结果与RT-PCR方法完全一致。以上结果说明,本试验所建立的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法为PEDV的快速检测提供了良好工具和技术支持。     

2018年广西重要猪源病毒性疫病流行病学调查

为了解2018年广西猪群重要疫病流行情况,试验采集广西各地的病死猪组织样品及病猪腹泻拭子,应用多重实时荧光定量RT-PCR检测猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,应用多重实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪圆环病毒3型（PCV3）,应用多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PRoV）。结果显示,所检测的694份组织样品中,CSFV、PRRSV、HP-PRRSV、PRV、PCV1、PCV2、PCV3的阳性率分别为11.10%、18.88%、7.20%、5.19%、2.45%、67.00%和5.76%;2种病原混合感染率为41.21%,3种病原混合感染率为4.32%,其中PRRSV和PCV2混合感染率最高。所检测的792份肠内容物及拭子腹泻样品中,PEDV、PDCoV、TGEV、PRoV的阳性率分别为9.72%、5.81%、1.77%和6.31%;2种病原混合感染率为5.30%,其中PEDV和PRoV混合感染率最高。结果表明,当前多种重要病毒性疫病仍在广西猪群发生和流行,并且多重感染普遍存在,应进一步加强监测和防控。     

猪流行性腹泻病毒的分离及RT-PCR方法的建立

应用RT-PCR方法对2012年华南地区某大型猪场疑似猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）病料检测,选取阳性病料接种vero细胞,培养至15代,出现明显的细胞病变。为了更好的检测该病毒,根据M基因设计引物,建立了一个快速的RT-PCR方法。     

2016－2019年广西部分猪场仔猪病毒性腹泻的流行病学调查

本研究旨在了解引起仔猪腹泻的主要病毒性病原感染情况及流行特点,为有效防控广西仔猪腹泻提供科学依据。试验采用RT-PCR/PCR检测方法对2016年3月至2019年2月广西14个地级市366个规模猪场送检的914份仔猪腹泻病料样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪Delta冠状病毒（PDCoV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪伪狂犬病病毒（PRV）检测,并分析其阳性率在不同年份、季节、地区之间的差异及病原混合感染情况。调查结果显示,PEDV、PDCoV、PRRSV、PoRV、PCV2、CSFV、PRV均存在不同程度的感染,其样品平均阳性率分别为59.74%、8.32%、7.77%、4.92%、3.72%、3.28%和2.08%,未检测出TGEV;PEDV已无明显季节性,一年四季均高发,即使在炎热的夏季,在感染猪群中也持续存在,PDCoV有明显的季节性,多发生在冬春寒冷季节;广西仔猪腹泻PEDV阳性率高,单一感染高达50.55%,仔猪腹泻混合感染情况也较多,其中以二重感染情况较为常见,同时也存在四重感染现象。结果表明,广西腹泻仔猪存在7种病毒性病原不同程度感染情况,其中以PEDV导致的仔猪病毒性腹泻尤为严重,新发PDCoV阳性率仅次于PEDV,需重视并加强对新发PDCoV的防控。     

常见引起仔猪腹泻的病原学特点

2010年冬季至今,我国许多猪场都发生了非常严重的仔猪腹泻,造成了较大的经济损失。传统的致仔猪腹泻的病毒主要有3个：猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和轮状病毒（porcine rotavirus,RV）,以及主要由上述3种病原引起的协同致病和混合感染,文中就引起常见仔猪腹泻的病原作简要综述。     

内蒙古二连浩特市猪病毒性腹泻的流行病学调查

正引起猪病毒性腹泻病的病原有很多,如猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)等,但以腹泻为主症的病原主要是TGEV、PEDV和PoRV 3种。据资料报道,猪病毒性腹泻病是猪的一类重要传染性疾病,呈世界性分布,给养猪业造成了严重的经济损失,尤其仔猪腹泻较为严重,