10种猪常见病毒基因芯片检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种可同步检测猪10种常见疫病病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)、猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)和口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus,FMDV)的基因芯片检测技术,为临床病料的初步诊断及流行病学调查提供一个新的可靠方法。对10种病毒基因的序列进行分析,设计引物对靶基因进行PCR扩增,将纯化后的靶基因点制成芯片,通过Cy3标记特异性引物扩增病毒得到具有荧光标记的探针,然后与芯片进行杂交,扫描分析结果,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法和普通PCR/RT-PCR方法对1 006份样品进行符合检测。试验结果表明,基因芯片检测10种病毒特异性好、灵敏度高,最低检测限度可达10~(5 )copies·μL~(-1),检测中,基因芯片与普通PCR/RT-PCR对1 006份临床样品的检测符合率为96.79%以上。初步研究表明,该基因芯片技术可同时同步检测10种猪疫病病毒,可应用于临床病料的初步诊断。     

宏基因组学技术分析四川省集约化猪场中仔猪腹泻粪便的病毒种群

旨在了解四川省集约化猪场腹泻仔猪粪便中病毒种群的变化。于2019年从四川省15个猪场采集腹泻仔猪粪便样本共156份，每个猪场挑取3份样本混合成1个pool样，提取其总RNA并进行高通量测序，利用SOAP denovo软件进行序列组装，并对病毒的种类和分子特征进行研究。分析结果显示，腹泻仔猪粪便样本中的病毒种群包括12个科的20种病毒，以冠状病毒科(Coronaviridae)成员为主，与腹泻相关的主要病原有猪流行性腹泻病毒(porcine pidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine infectious gastroenteritis virus, TGEV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)。获得PEDV N基因的完整基因组和TGEV、猪星状病毒2型(porcine astrovirus, PAstV-2)、posavirus 1和猪细小病毒4型(porcine parvovirus, PPV-4)的部分基因组。系统发育结果显示，PEDV、TGEV、PAstV-2、posavirus 1和PPV-4均与参...     

猪主要腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×10²,1.44×10²,1.51×10²和1.56×10²拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病...     

新疆地区4种猪病多重PCR检测方法的建立与初步应用

本试验旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mh)的多重PCR检测方法。参考相关文献合成PRRSV、PCV2、PRV、Mh的特异性引物,通过对反应条件优化、特异性、敏感性测定,建立了可同时检测以上4种猪多发传染病的PCR诊断方法。扩增的片段长度分别为424 bp (PRRSV)、490 bp (PCV2)、298 bp (PRV)和360 bp (Mh),对其他常见猪病病原无特异性扩增,采用Multiplex PCR Master Mix对PRRSV、PCV2、PRV、Mh的核酸最低检出量为3个拷贝。采用多重PCR方法对60份临床样本反复检测,与单重PCR相比,4种病原符合率均为100%。结果表明,建立的多重PCR诊断方法可用于猪群中上述4种病原的单一或混合感染的快速鉴别诊断和流行病学调查。     

同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10³,1.13×10³,1.31×10²和1.18×10^2<...     

浙江省部分地区猪病毒性腹泻的流行病学调查

正猪病毒性腹泻是一类呈全国性散发流行的急性、接触性肠道传染病。临床上以引起仔猪水样腹泻、呕吐、脱水消瘦甚至死亡为典型症状,成年猪多不可见临床症状或仅有一过性软便。该病病原主要有猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(porcine     

常见引起仔猪腹泻的病原学特点

2010年冬季至今,我国许多猪场都发生了非常严重的仔猪腹泻,造成了较大的经济损失。传统的致仔猪腹泻的病毒主要有3个：猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和轮状病毒（porcine rotavirus,RV）,以及主要由上述3种病原引起的协同致病和混合感染,文中就引起常见仔猪腹泻的病原作简要综述。     

猪冠状病毒的起源与遗传演化

冠状病毒变异率高,宿主广泛,主要感染哺乳动物和禽类,严重威胁公共卫生安全与养殖业发展.生猪养殖业中,冠状病毒也是危害猪只健康的重要病原.本研究对4种代表性猪冠状病毒:猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic...     

2009-2010年云南部分猪场猪主要传染病血清流行病调查

为了探查2009-2010年云南部分猪场对猪主要传染病疫苗接种后的免疫效果,本试验主要通过ELISA方法对样品进行血清流行病调查。结果表明,猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)抗体阳性率为84.33%(1211/1436);猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体阳性率为74.84%(803/1073);猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)抗体阳性率为0.00%(0/80);猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)抗体阳性率为62.26%(287/461);猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)抗体阳性率为54.25%(83/153);日本乙型脑炎抗体阳性率为63.33%(76/120)。提高PRRSV、PRV、PPV和乙脑疫苗的使用效果是云南省内猪场解决母猪流产的有效途径。     

参加行业会议对养猪场生物安全影响调查

通过使用GenoTube采样拭子管对2018年两次国内大型畜牧行业会议的现场及周边环境、车辆、参会人员及其携带物进行了持续3 d的样品采集,收集的样品经预处理和混样处理后,采用实时荧光定量PCR(qPCR)的方法对2种常见的猪病毒性疾病病原——猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)进行了实验检测、分析。通过对检测结果进行统计分析,发现在2次会议样品中均检测出了PEDV阳性或PRRSV阳性,其中,PEDV阳性混合样品和PRRSV阳性混合样品分别占总采样数量的27.6%,2.0%。另外,环境样品中检测出双阳性。结果表明,业内人员密集的大型行业会议环境消毒不彻底、参会人员及相关物品携带猪病毒性疾病病原,增加了病原交叉传播的风险,行业会议的生物安全管理工作亟待提高。综上,此调查旨在通过提高业内人士的生物安全意识,降低行业会议中猪病的病原传播与交叉污染的风险,调查结果为开展并加强畜牧行业大型会议的生物安全管理工作提供了案例参考和理论依据,从而减少会议中病原传播和交叉污染对畜牧生产的不利影响及其引起的企业与社会的经济损失。     

猪蓝耳病活疫苗中猪瘟外源病毒检测

试验采用IFA法对2批随机抽样的PRRS活疫苗(每批4瓶)、阳性对照(CSFV)、阴性对照(未被CSFV污染的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV))和特异性试验检测病毒(猪圆环病毒2型(porcine circo virus 2 type,PCV-2))接种于生长良好的PK-15细胞进行间接免疫荧光染色检测CSFV,以期建立快速、准确的间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)调查猪蓝耳病活疫苗中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的污染情况;在不同时间、相同试验条件下,相同批次的疫苗被重复检测了3次。试验结果表明:阳性对照接种的PK-15细胞出现特异性黄绿色荧光,阴性对照、PCV-2和待检样品接种的PK-15细胞均未出现特异性黄绿色荧光,即待检2批PRRS活疫苗未被CSFV污染;通过3次重复操作,最终的检测结果一致,说明IFA检测猪瘟病毒包涵体的特异性强、敏感性高。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、准确、常规的猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)检测方法,根据PHEV N蛋白基因序列,设计1对引物和1条探针,建立了PHEV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法特异性好,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应;用阳性质粒Puc57-PHEVn评估其敏感性,发现检测下限达10~(-6) ng/μL(224拷贝/μL)。采集233份发病猪组织样品进行临床检测,发现该方法与巢式RT-PCR的符合率达98.3%,准确筛查出巢式RT-PCR并测序阳性的样品14份,且检出率高于巢式RT-PCR。结果表明,本方法敏感、特异,可用于PHEV临床样品的检测。     

PEDV、TGEV、PoRV 3种猪病毒性腹泻病毒的流行现状及控制策略

引起猪病毒性腹泻的病原主要有猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)及猪轮状病毒(porcine rotarvirus,PoRV),临床均以呕吐、严重腹泻和脱水为特征,哺乳仔猪发病率和病死率较高,后备猪、母猪或育肥猪呈一过性腹泻,发病率较低。特别是自2010年以来,PEDV变异毒株的流行已对全球的生猪产业造成严重影响,而已有的防控措施已经不能应对新的流行态势。近年来,针对PEDV、TGEV、PoRV的毒株流行变化及防控措施研究的较多,许多新技术、新方法已应用于3种病原的控制。作者基于当前3种病毒的遗传变异分析和流行现状,从饲养管理、免疫预防、中药疗法、干扰疗法、特异疗法及返饲疗法等方面对防控措施进行综述,以期为猪病毒性腹泻的防控提供科学依据。     

断奶仔猪腹泻病因分析

为了解云南省断奶仔猪腹泻的致病性原因,通过对30个发生断奶仔猪腹泻猪场的210份粪便、60份饮用水,总计270份样品,进行病毒及致病性细菌分析。研究结果表明,致病性大肠杆菌严重污染饮用水,致病性大肠杆菌在饮用水中检出40株,阳性率为66.7%,粪便中检出100株,阳性率47.6%;致病性沙门氏菌在饮用水中检出10株,阳性率为16.7%,粪便中检出24株,阳性率为11.4%,均对亚胺培南敏感。在粪便中猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirous type 2,PCV2)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)及猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)的PCR扩增阳性率为5.2%~13.0%,在饮用水中未检出。通过对云南省断奶仔猪腹泻进行病因分析,了解断奶仔猪腹泻的具体原因,本试验结果为从病因入手防制该病提供更合理、更切合实际情况的理论依据与试验参考。     

2009—2010年部分猪场猪主要传染病流行病学调查

本试验旨在了解2009—2010年云南部分猪场猪主要传染病的流行情况,通过对云南地区病例的临床诊断、流行病史调查、病理剖检和实验室确诊,最后统计猪主要传染病疑似病料阳性率。其中,猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)检出率为22.46%(31/138);猪繁殖与呼吸道综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)检出率为26.23%(32/122);猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)检出率为91.30%(84/92);伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)检出率为46.99%(39/83);病原菌检出率为41.07%(23/56);猪肺炎支原体检出率为33.33%(13/39);弓形虫检出率为50.00%(8/16);猪附红细胞体检出率为14.29%(6/42)。     

猪圆环病毒特点

<正>猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)有2种不同的血清型,即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1暂无致病性,PCV2被认为是引起猪圆环疾病(PCVDs)的主要病原。现就PCV的病原特点进行综述。1结构与特性     

猪流行性腹泻病毒RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的建立与初步应用

将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification, RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合，即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)检测方法。针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸，并进行CRISPR-Cas13a荧光检测，以RT-qPCR为对照方法，评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性。结果表明，该方法最低可检测至10¹ copies·μL^-1,且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应。采用RAA-Cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881。本研究建立的RAA-Cas13...     

应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测Ⅱ型猪圆环病毒

Ⅱ型猪圆环病毒（porcine circovirus type2，PCV-2）为近年来引起多种综合征的重要病原，且经常与猪呼吸与繁殖障碍综合症、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流感病毒发生混合感染。建立对于该病毒的快速检测及准确定量的方法，无疑对于病原诊断及病因学研究具有重要的意义。实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、速度快、操作简便和污染少等优点。     

非洲猪瘟病毒K196R基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒定量检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)早期表达基因K196R的基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针浓度,建立了快速检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法选择的引物具有高度灵敏性和特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系(R~2=0.998),对ASFV核酸最低检测下限为1.3拷贝,且与猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应。本研究建立的K196R基因实时荧光定量PCR检测方法为非洲猪瘟疫情提供了一种新型、灵敏和特异的早期检测方法。