柔嫩艾美耳球虫在鸡胚盲肠上皮细胞中体外培养营养条件的研究

探讨E.tenella在鸡胚盲肠上皮细胞体外培养的营养条件,观察其发育过程。用鸡胚盲肠上皮细胞体外培养E.tenella,对子孢子接种基础培养基、营养物质含量及血清浓度进行了优选,并对优化营养条件下E.tenella的发育过程进行了观察。MEM199培养基中24、48、72h的虫体感染率显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于DMEM培养基;MEM199培养基中叶酸、VB6、VB1的含量为6mg·L-1时,24、48、72h的虫体感染率显著(P0.05)高于其他组,分别为25.33%、12.67%和12.33%;MEM199培养基中葡萄糖含量为3000mg·L-1,胰岛素含量为0.40mg·L-1时,有较多的成熟裂殖体形成;接种子孢子后于4、48、96h换液,接种时和4、48h血清浓度为2.5%,96h为1%,有利于子孢子的后期发育;优化营养条件下,细胞接种子孢子后4、24、48、72、96、120h的细胞虫体感染率分别为42%、28%、20%、15%、13.67%、13.67%,且E.tenella可在鸡胚盲肠上皮细胞中完成内生发育过程,并形成卵囊。结果表明,获得了能使E.tenella在鸡胚盲肠上皮细胞完成整个内生发育的体外培养营养条件。     

堆型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫卵囊最短孢子发育时间的测定

将收集到的新排出的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)与柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)卵囊于29℃静态系统中孢化。以30min为间隔，对卵囊孢子发育的4个阶段在显微镜下进行观察。以1h为间隔，用发育中的卵囊连续接种无球虫鸡，以确定最短孢子发育时间(MST)。对影响孢子发育的外部因素进行了初步探讨。用堆型艾美耳球虫比较不同卵囊浓度，不同悬液深度在卵囊孢化过程中第20h时子孢子形成的卵囊百分率。E.acervulina与E.tenella的MST分别为11b与18b。卵囊浓度和悬液深度与孢子发育时间呈明显反比关系。     

艾美尔球虫子孢子体外刺激鸡异嗜白细胞和巨噬细胞炎性细胞因子表达水平

以实时荧光定量PCR方法检测了艾美尔球虫(Eimeria tenella)子孢子体外刺激鸡异嗜白细胞和巨噬细胞炎性细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-12mRNA表达水平。结果发现,与不刺激对照组相比,活的E.tenella子孢子刺激异嗜白细胞(4h)和巨噬细胞IL-6mRNA表达水平显著增加(P<0.05)。灭活的E.tenella子孢子刺激异嗜白细胞和巨噬细胞IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-12mRNA表达水平均高于活的E.tenella子孢子,差异显著(P<0.05)。与不刺激对照组相比,灭活的E.tenella子孢子刺激异嗜白细胞IL-6、IL-10、IL-12(2h)和IFN-γ(4h)mRNA表达水平均显著增加(P<0.05),灭活的E.tenella子孢子刺激巨噬细胞IL-6、IL-12和IFN-γmRNA表达水平显著上调(P<0.05)。表明,鸡异嗜白细胞和巨噬细胞受到E.tenella子孢子刺激后炎性细胞因子的显著上调可能与机体清除球虫感染有关。     

鸡球虫体外HCT-8细胞培养模型的建立

由柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)引起的球虫病严重损害鸡的肠道健康,给养鸡业造成巨大的经济损失。E.tenella寄生在鸡盲肠上皮细胞,体外培养可在鸡原代肾细胞内发育成卵囊完成内生发育过程,而在其他传代细胞系内只能完成部分生殖阶段,为了延长其在细胞内的发育进程,建立了鸡球虫HCT-8细胞培养模型。将新鲜制备的E.tenella子孢子接种HCT-8细胞,制备细胞爬片,分别进行HE染色和DAPI染色,观察子孢子在细胞内的发育状况。结果表明,子孢子在接种后6 h即可入侵HCT-8细胞,随后子孢子发育为滋养体至48 h形成第一代裂殖体,至54h第一代裂殖子释放,于72 h形成第二代裂殖体,在144 h第二代裂殖子释放出来,继续培养至168h未见到卵囊形成,而试验虫株接种鸡体后在144～168 h即可观察到大量未孢子化卵囊排出体外,据此确定子孢子在该细胞内的发育过程结束。本研究所建立的鸡球虫细胞培养模型将子孢子发育至第二代裂殖生殖阶段,将发育阶段向前推进了一个进程,为鸡球虫相关研究工作的开展提供技术平台。     

E.tenella鸡胚盲肠上皮细胞体外培养的影响因素

研究E.tenella子孢子的纯化方法、接种剂量以及细胞生长状态对E.tenella在鸡胚盲肠上皮细胞体外培养中的影响,为E.tenella鸡胚盲肠上皮细胞体外培养模型的建立提供依据。以子孢子回收率和细胞感染率为指标,对DE52纤维素层析法、蔗糖密度梯度离心法和双层目筛过滤法纯化子孢子的效果进行比较;测定了子孢子接种剂量和细胞生长状态对虫体感染率的影响,并对各发育阶段的虫体进行观察。结果表明,采用双层目筛过滤法可得到纯净的子孢子,并且回收率和接种细胞后24、48h的虫体感染率均显著(P0.05)和极显著(P0.01)高于DE52纤维素层析法和蔗糖密度梯度离心法;在48孔细胞培养板中,子孢子的最佳感染剂量为每孔10万个;鸡胚盲肠上皮细胞覆盖率为85%~90%且贴壁细胞融合率在30%以上时接种子孢子,各时间段虫体的入侵率较高,且可以观察到E.tenella主要发育阶段的虫体。本研究获得了能使E.tenella在鸡胚盲肠上皮细胞完成整个内生发育的子孢子纯化方法、接种剂量和细胞生长状态。     

牛附红细胞体体外培养试验

用RPMI－1640、M－199、D－MEM3种培养液作为基础培养基，再分别按体积分数加入40％的犊牛血清，采用普通恒温培养箱（37℃）进行牛附红细胞体体外培养。结果表明，牛附红细胞体在RPMI－1640培养基中，每12h更换1次培养液，并补充适量正常红细胞，获得了高达99％的感染率；连续传代培养可达44代以上。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子高表达新基因的克隆、表达及分析

为克隆和研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)新基因,本研究在所获得的ESTs序列的基础上,应用RACE技术克隆获得了1个在子孢子阶段高表达新基因的全长cDNA序列(GU553107),命名为ZB7-C11,该基因全长1439bp,ORF为525bp,编码174个氨基酸,预测表达蛋白的分子量约为18.7ku。Real-timePCR对E.tenella不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析显示,该基因在子孢子阶段的表达高于其它阶段。另外,将ZB7-C11克隆于pGEX-4T中构建重组质粒pGEX-4T-C11,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达6h后其表达量最高,并且重组蛋白分子量约44.7ku大部分以可溶性存在。Westernblot分析显示该重组蛋白可被抗E.tenella的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

不同型牛血清对家兔原核胚序贯培养体外发育的影响

采用不同型血清分别添加到TCM199和mTCM199培养液、RPMI1640和mRPMI1640培养液中，对兔原核期受精卵进行了体外序贯培养，并对各组间不同时期发育率进行了分析比较。结果显示：体外培养至第72h时，3个体外序贯培养体系间8-细胞胚率、桑椹胚率差异不显著（P〉0．05），当体外培养至囊胚时，100mL／L NBS＋TCM199（mTCM199）培养体系、100mL／L NBS＋RPMI1640（mRPMI1640）培养体系的囊胚率均显著低于100mL／L FBS＋RPMI1640（mRPMI1640）培养体系的囊胚率（三组的囊胚率依次是27．3％、35．9%、97．2%，P〈0．01）。但前两组之间差异不显著。结果表明，不同型血清对兔早期胚胎体外正常发育具有很大影响，序贯培养中添加国产NBS的培养液的培养效果明显低于添加进口FBS的培养液的培养效果。     

多房棘球绦虫-泡球蚴的体外培养研究

按照多房棘球绦虫幼虫-泡球蚴培养的培养基（RPMI-1640、M199和MEM）分为3组：Ⅰ组为含10％胎牛血清的RPMI-1640;Ⅱ组为含10％胎牛血清的MEM;HI组为含10％胎牛血清的M199。将泡球蚴在3种细胞培养液中进行培养,观察其存活、生长以及发育情况。结果显示,培养9d的泡球蚴的成活率分别为：Ⅰ组90．10％、Ⅱ组50．25％、Ⅲ组22．03％;成囊率分别为：Ⅰ组57．12％、Ⅱ组63．15％、Ⅲ组48．17％;头节外翻率分别为：Ⅰ组98．28％、Ⅱ组88．65％、Ⅲ组75．50％。可见,大多数虫体在早期向囊发育,一部分虫体头节外翻,并伴有规律的伸缩运动,但随时间的延长虫体运动减缓,又向囊蚴发育。通过对多房棘球绦虫泡球蚴的体外培养,初步表明合有10％小牛血清的细胞培养基RPMI-1640较适合泡球蚴的生长发育,为研究寄生虫发育提供了最基本的数据资料。     

猪血管内皮细胞体外生长特性的研究

试验以体外分离培养的猪血管内皮细胞为材料，研究了细胞的生长曲线、不同基础培养基对细胞生长的影响及胰岛素在生长液中的适宜含量。结果表明，传代猪血管内皮细胞接种后有ld左右的滞留期，然后细胞进入对数生长期，可持续2d，第5d进入平台期，第8d细胞开始脱落死亡；与MEM相比，M-199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基；在不用贴附基质和内皮细胞生长因子(ECGF)的条件下，生长液中加入胰岛素，可明显促进细胞的生长和增殖，胰岛素的最适用量为8μg／mL。     

细粒棘球绦虫——原头蚴在两种细胞培养液中体外培养的初步观察

通过原头蚴在两种细胞培养液中（RPMI-1640和MEM）培养,观察其存活、生长及发育情况,从而为研究寄生虫发育提供最基本的数据资料。方法：细粒棘球绦虫幼虫——原头蚴培养的细胞培养基（RPMI-1640和MEM）分为4组：Ⅰ组为纯RPMI-1640培养液;Ⅱ组为含10％的小牛血清的1640培养液;Ⅲ组为纯MEM培养液;Ⅳ组为含10％的小牛血清的MEM培养液;并进行对比观察。结果：培养15d的原头蚴的成活率分别为：Ⅰ组69．87％、Ⅱ组80．35％、Ⅲ组50．25％、Ⅳ组60．32％;成囊率分别为：Ⅰ组80．58％、Ⅱ组90．25％、Ⅲ组35．65％、Ⅳ组45．89％;头节外翻率分别为：Ⅰ组95．50％、Ⅱ组98．65％、Ⅲ组60．52％、Ⅳ组70．98％。结论：大多数虫体在早期向囊发育,一部分虫体头节外翻,并伴有规律的伸缩运动,但随时间的延长虫体运动减缓,又向囊蚴发育。通过对细粒棘球绦虫的原头蚴的体外培养,初步表明含有10％小牛血清的细胞培养基RPMI-1640较适合原头蚴的生长发育,在普通培养箱中培养,最适温度在37—40℃,培养液pH=7．2,初步建立了原头蚴体外培养的方法。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子ScFv-PE40重组毒素活性的测定

将诱导获得的可溶性表达产物抗堆型艾美耳球虫子孢子ScFv-PE40重组毒素,加入含有脱囊后的子孢子的1640培养液中,观察14 h内活动的子孢子数目和活动性的变化,结果与对照组相比,加入重组毒素组的活动子孢子数目明显减少(P<0.05),活动性明显降低,提示重组毒素对鸡堆型艾美耳球虫子孢子具有较强的杀灭作用.从而为鸡堆型艾美耳球虫病的免疫控制研究提供技术手段和理论依据.     

柔嫩艾美耳球虫Etron2基因在不同发育阶段转录水平差异的分析

为研究柔嫩艾美耳球虫不同发育时期Etron2基因的转录水平差异,选取E.tenella生活史中的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子,分别提取总RNA,反转录为cDNA;选择Etactin作为参照基因,Etron2为目的基因,设计实时荧光定量PCR的引物,分析在E.tenella生活史中不同发育阶段Etron2转录水平的差异。结果显示Etron2在未孢子化卵囊中转录水平最高,然后分别是裂殖子、孢子化卵囊和子孢子。在柔嫩艾美耳球虫发育过程中,Etron2基因可能在未孢子化卵囊阶段被转录储备,随着宿主细胞的刺激,得以大量表达,在入侵过程中发挥作用。     

不同保存条件对绵羊卵巢组织卵泡存活的影响

研究旨在通过组织学方法评估卵巢保存形式、温度、时间、保存液对绵羊卵巢组织短期保存以及培养后卵泡存活的影响。结果表明:碎块或整个卵巢组织39℃保存6 h或12 h后,正常卵泡比例与新鲜组织和其他组比较显著下降(P0.05)。经过6 d的组织培养后,在生理盐水中4、20℃保存6、12 h和39℃保存2 h以及在MEM中39℃保存2 h的组织碎块中正常卵泡比例显著低于整个卵巢保存后组织中正常卵泡比例(P0.05)。在MEM中4℃保存6 h或12 h,培养后卵泡存活率显著高于相同条件保存于生理盐水中的组织(P0.05)。此外保存12 h培养后正常卵泡比例显著低于保存2 h处理组(P0.05)。表明在生理盐水和MEM中整个卵巢4、20℃保存2~6 h,或者卵巢碎块20℃保存在MEM中2~6 h都可以用于卵巢体外培养的研究。     

不同样品保存液和保存条件对动物细胞体外培养的影响

本研究取矮脚油鸡7日龄胚胎作为试验材料,用MEM、全培养基和PBS 3种不同的液体对鸡胚组织进行保存,同时在不同保存温度条件下按不同保存时间梯度,采用组织块贴壁培养法进行体外细胞培养。对细胞的保存液变化,细胞形态、细胞生长等情况进行研究,分析样品保存条件对细胞体外培养和细胞系构建的影响。结果发现,4 ℃保存的组织块培养效果明显优于室温保存;无论在4 ℃或常温,基础培养基保存的组织块培养效果明显优于保存液,全培养基效果最好。常温保存48 h以内3种保存液培养效果差别甚微,48 h后培养效果均急剧下降,96 h后保存在PBS中的组织失活,未长出细胞。本研究结果为建立细胞系采集样品的保存提供了一定的参考。     

E.tenella感染早期雏鸡盲肠扁桃体ChIL-17A和ChIL-17F表达水平的相反变化

为探讨ChIL-17及其受体在抗柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)感染中的作用,本研究用E.tenella RC株孢子化卵囊口服感染14日龄非免疫蛋公鸡,于感染后0,2,4,6,12,24,3,5,7d共9个不同时间点同时提取对照组和试验组雏鸡盲肠扁桃体RNA,采用实时荧光定量PCR方法检测ChIL-17A、ChIL-17F和ChIL-17RA基因的表达动态。结果显示,ChIL-17A表达水平在感染后持续下调,感染后4h为感染前(0h)的0.13倍(P0.01),感染后3d达最低表达水平,仅为感染前(0h)的0.009 7倍。而ChIL-17F的表达水平则呈现相反的变化,在感染早期明显上调,感染后2h上调3.07倍(P0.05),感染后4h上调6.49倍(P0.01),其后时间点与感染前相比表达水平则无显著性差异。ChIL-17RA与感染前相比表达上调,于感染后24h和7d分别上调1.73倍和2.21倍(P0.01)。结果表明,ChIL-17及其受体基因的表达水平在感染后均呈现显著变化,说明它们在E.tenella感染中具有重要的宿主-寄生虫免疫生物学意义。特别是ChIL-17A和ChIL-17F在感染早期(感染后2~4h)表现出显著的相反表达动态说明两者在宿主防御E.tenella感染的早期具有不同的免疫调节功能,而这一具体调节机制还有待于进一步的研究加以阐明。     

单味中草药对球虫卵囊体外抑制的试验研究

为了观察中草药对球虫卵囊体外孢子化抑制的影响,试验将不同浓度的常山、青蒿、白头翁等16味中草药与柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)卵囊在28℃条件下培养4~6 d,计数卵囊的孢子化率。结果表明:所选中草药均极显著抑制卵囊孢子化(P0.01),并随着药物浓度的增加,卵囊孢子化率呈下降趋势,其中以青蒿、使君子、草果、苦参等中草药的抑制效果最好。     

粪便保存条件、时间对鸡球虫卵囊活力的影响实验

为探讨在不同温度条件下粪便保存不同时间对球虫卵囊成熟力的影响,本实验将含有球虫卵囊的粪便在-20℃、4℃、20℃、28℃分别保存0 h、24 h、48 h、72 h,通过观察卵囊的孢子化率确定最佳保存条件。结果表明:相同保存温度条件下,保存0 h、24 h、48 h、72 h的E.tenella早熟耐药株卵囊的孢子化率依次降低。-20℃和28℃时孢子化率均未达到80%;在4℃时粪便保存24 h的孢子化率达到80%以上,保存48h及以上时孢子化率极显著(P0.01)低于保存24 h的孢子化率;在20℃时的孢子化率均达到80%以上。     

柔嫩艾美耳球虫多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的基因表达及转录动态分析

蛋白质翻译后O-糖基化修饰普遍存在于真核生物、细菌和古细菌,多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(polypeptide:N-acetylgalactosaminyltransferase 2,ppGalNAc-T2)是O-糖基化反应的限速酶。基因组数据分析揭示艾美耳球虫具有O-糖基化反应途径。为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)蛋白质翻译后糖基化修饰及其关键酶的药靶效用,对Et ppGalNAc-T2基因进行了克隆,并检测其在E.tenella不同发育阶段的表达动态。根据EuPathDB中所预测Et ppGalNAc-T2基因序列设计引物,以RT-PCR方法扩增获得Et ppGalNAc-T2的ORF,插入酶切位点后连接到原核表达载体pGEX-6p-1进行诱导表达。提取E.tenella广东株未孢子化卵囊、孢子化7h卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子5个发育阶段的总RNA,以qRT-PCR法检测Et ppGalNAc-T2转录水平的动态变化。结果表明,Et ppGalNAc-T2的全长ORF为1 983bp,编码660个氨基酸,在E.coli Transetta(DE3)可溶性表达。qRT-PCR结果显示,Et ppGalNAc-T2转录水平随发育阶段不同而有显著差异,子孢子阶段表达水平最高、而在孢子化卵囊则几近不能检出。结果为进一步研究EtppGalNAc-T2的功能提供了试验基础。     

两种不同培养基对巨噬细胞培养的影响

以无血清RPMI-1640培养液和DMEM培养液分别灌洗小鼠腹腔，10min后分别吸出灌洗液于100mL／L胎牛血清和DMEM培养液中培养．巨噬细胞吞噬试验检测其活性、台盼蓝测定体外培养细胞的存活率和成层率。结果表明．DMEM培养基体外培养的巨噬细胞存活率和成层率高、吞噬能力强，与RP—MI-1640相比，DMEM可作为一种简单而实用的体外分离培养巨噬细胞的培养基。