鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因的克隆与测序

提取堆型艾美耳球虫子孢子杂交瘤细胞总RNA,进行RT PCR,扩增出重链可变区基因。将已扩增出的鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因片段与pMD 18T载体连接,重组载体转化于感受态细胞JM109,筛选出阳性重组子,提取阳性重组子质粒并进行测序,得到单抗重链可变区的基因序列,为单链抗体基因的构建及免疫毒素的构建奠定了基础。     

毒害艾美耳球虫鸡胚培养研究

为了建立毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)的鸡胚培养体系,用毒害艾美耳球虫子孢子分别接种8～11日龄鸡胚以确定最佳接种日龄,用不同剂量子孢子接种同一日龄鸡胚以确定最佳子孢子接种剂量,并在子孢子混悬液中分别加入不同剂量的胰岛素和叶酸以观察对球虫在鸡胚中发育的影响.结果显示,毒害艾美耳球虫子孢子接种9日龄的鸡胚,其卵囊产量(平均每只胚的卵囊量)和卵囊成熟率均为最高,成熟率达到99%;当每个鸡胚接种子孢子1×104个时,其卵囊产量最高;在子孢子混悬液中分别加入胰岛素1 000 U/mL、叶酸0.05 mg/mL,均能明显增加鸡胚中的卵囊产量.本文通过对毒害艾美耳球虫的鸡胚接种日龄、子孢子接种剂量、营养物质添加等因素的研究,初步建立了毒害艾美耳球虫的鸡胚培养体系.     

宿主GAPDH对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响

目前,关于宿主细胞应对球虫感染机制的研究极其有限。在前期研究中,我们利用相对和绝对定量同位素标记技术结合液相色谱串联质谱技术分析了感染柔嫩艾美耳球虫子孢子72 h后鸡胚成纤维(CEF)细胞的蛋白质组表达变化,作者拟进一步研究其中一个上调蛋白——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。克隆鸡GAPDH基因并构建原核重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,表达重组GAPDH蛋白,用Western blot对表达进行验证。使用q-PCR、Western blot和免疫组织化学的方法检测感染柔嫩艾美耳球虫子孢子后DF-1细胞中GAPDH的表达量,并使用抗体抑制试验检测GAPDH多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。结果显示:成功克隆1 123 bp的GAPDH基因,并获得61.7 ku的重组GAPDH蛋白。q-PCR和免疫组织化学检测均显示,GAPDH在柔嫩艾美耳球虫子孢子感染的DF-1细胞中的表达显著升高。抗体抑制试验表明,与相同浓度的正常兔IgG相比,50、100、200、300和400μg·mL~(-1)的抗GAPDH抗体均能明显抑制子孢子的入侵。以上结果表明,子孢子感染会引起宿主细胞GAPDH蛋白的上调,并且宿主GAPDH蛋白在子孢子入侵过程中起正调控作用。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子单抗对阶段特异性抗原的识别

为了用针对堆型艾美耳球虫子孢子的5株单抗检测各代裂殖子的反应性,分别用甲醇、丙酮、戌二醛和自然干燥等4种固定方法处理裂殖子,观察其对染色结果的影响;并运用免疫荧光技术（IFA）,对单抗和裂殖子进行染色。结果显示,5株单抗中,单抗Easp-3H6和单抗Easp-5G10识别堆型艾美耳球虫裂殖子的抗原位于裂殖子的顶端,单抗5B4对各阶段裂殖子有较弱的反应,而单抗Easp-3G3和5G7不与堆型艾美耳球虫任何一代的裂殖子发生反应,表明鸡堆型艾美耳球虫的侵入阶段存在共有抗原,即种内各发育阶段的抗原。     

堆型艾美耳球虫子孢子和鸡十二指肠上皮细胞的共同抗原的研究

以抗堆型艾美耳球虫子孢子的单抗EASP-3G3作为工具,对鸡各段消化道上皮细胞切片和子孢子进行免疫组化染色,并利用蛋白质印迹技术来检测单抗所识别子孢子可溶性抗原的分子量,来确定子孢子和十二指肠上皮细胞之间是否存在共同抗原。结果表明单抗只与十二指肠上皮细胞发生反应,而与其他肠段无染色反应。而且单抗所识别的可溶性抗原分子量为35~48 ku。抗子孢子的单抗同时与十二指肠上皮细胞和子孢子反应,而不与其他肠段反应,证明堆型艾美耳球虫寄生的位点特异性与十二指肠上皮细胞表面的某种抗原分子有内在的关系。     

不同发育期两种艾美耳球虫在鸡消化道内的分布

对柔嫩艾美耳球虫Eimeria teenlla和巨型艾美耳球虫Eimeria maxima的卵囊、孢子囊和子孢子在鸡消化道和粪便中的分布情况进行了研究。口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊第1小时后,盲肠内孢子囊数为3.4×10~8、以后则逐渐减少;而子孢子数增加且直到接种后第12小时仍保持一个高水平。其它肠段只有少量的孢子囊和子孢子。在接种巨型艾美耳球虫卵囊后的第2小时,主要在空肠内发现有大量的子孢子。研究发现,柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的绝大多数子孢子分别寄居在盲肠和空肠内,表明每种球虫子孢子侵袭部位的特异性在侵袭发生前就确定了。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建

为了筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵相关的蛋白,利用酵母双杂交体系构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。提取纯化的子孢子总RNA,经MMLV-RT反转录合成cDNA第一链后,利用LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA),dscDNA经纯化柱CHROMA SPINT+TE-400 Columns纯化剔除小于200 bp的片段。将纯化后dscDNA、pGADT7-Rec及Carrier DNA共转化到已经制备好的酵母感受态细胞Y187中,dscDNA与pGADT7-Rec以同源重组的方式在细胞内进行连接,经过缺陷性培养基(SD/-Leu)的筛选得到酵母双杂交cDNA文库。结果显示,构建的柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的转化率为4.33×105/μg pGADT7-Rec,文库滴度为3.62×107 cfu/m L。随机挑取32个单克隆进行PCR检测,插入片段大小为200~2000bp,重组率为93.75%,并以该文库作为模板,用柔嫩艾美耳球虫5对特异性引物进行PCR扩增,获得了这5个基因片段。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选和研究球虫入侵互作蛋白奠定了基础。     

鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗轻链可变区基因的克隆与序列测定

将已扩增出的鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗轻链可变区基因进行纯化,并用纯化的基因片段与pMD-18T载体连接,将重组载体转化于感受态细胞JM109,筛选出阳性重组子,提取阳性重组子质粒并进行测序,得到特异性单抗轻链可变区的基因序列。为鸡堆型艾美耳球虫特异性单链抗体基因的构建奠定了基础。     

鸡堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子的纯化试验

用DEAE－52层析法去除鸡堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子中对其免疫、生化分析、细胞培养等研究产生不良影响的孢子囊壁等杂质，以获得纯化子孢子，收到满意结果。     

鸡球虫病的诊治

鸡球虫病是由柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫等引起的鸡肠道寄生虫病。该病感染途径是鸡吞食孢子化卵囊而感染。凡被带虫鸡污染过的饲料、饮水、土壤