鸡传染性喉气管炎病毒的分离与鉴定

采用鸡胚传代方法从内蒙古地区两个发病鸡场分离到两株传染性喉气管炎病毒(分别命名为ILTV-NM98a、ILTV-NM98b株),进行了系统的常规生物学特性和部分分子生物学特性鉴定。结果表明,两个分离株对乙醚、氯仿、热均敏感。电镜下可见病毒粒子近似球形,有囊膜,大小在150~300nm之间。两分离株均能被标准阳性血清中和。接种60日龄抗体阴性鸡的发病率分别为100％和80％,死亡率分别为26.7％和6.7％。以两个分离株及参考株的DNA为模板,gB-1、gB-2为引物,以PCR方法扩增出gB基因片段,片段大小完全一致。扩增产物经Pst Ⅰ、Bg1Ⅱ、HindⅢ内切酶酶切后的酶切图谱与参考株完全一致。     

用PCR技术鉴定犬细小病毒弱毒疫苗株

通过分析比较犬细小病毒(CPV)弱毒疫苗株和强毒株的基因序列，设计了3条引物并组成2对引物，对弱毒疫苗株和强毒株进行了半嵌套式PCR扩增。第1轮PCR扩增的结果为CPV弱毒疫苗株和强毒株有相同的目的片段(585bp)；第2轮PCR扩增的结果为CPV强毒株有375bp目的片段，而CPV弱毒疫苗株没有375bp目的片段。对PCR产物进行电泳和酶切分析，结果证明PCR产物片段大小和酶切位点与设计的产物完全一致。特异性和敏感性测定结果表明，该方法是高度特异和敏感的，可用于弱毒疫苗毒株与强毒株的鉴定。     

传染性支气管炎病毒山东及北京分离株血清型及RFLP基因分型的比较研究

分离并鉴定出山东省不同地区的IBV分离株A、B、C、D和北京分离株F，利用中和试验分别对各分离株及标准株M41、T等进行血清分型。设计一对此物，分别对各毒株的S1基因进行RT－PCR扩增，扩增片段长约1700bp，利用其PCR产物进行HaeⅢ酶切，根据酶切图谱，进行基因分型。结果表明：A、C、D和M41酶切图谱相同，属Mass基因型，分别为900、400和300bp左右的片段；北京F株有4条酶切条带，与4／91基因型不同，分别为1000、300、200和小于100bp左右的片段；B株有4条酶切条带，理论推断与T株相似，分别为700、500、300和180bp左右的片段，可能为同一基因型。血清学分型结果与基因分型结果不符。     

猪巨细胞病毒GX株gB基因的克隆与序列分析

从广西病猪的肺组织中分离到猪巨细胞病毒GX株,通过PCR扩增得到猪巨细胞病毒GX株gB基因的一个1736bp片段,扩增产物经克隆、测序,得到的核苷酸序列与GenBank上已发表的猪巨细胞病毒其他分离株的核苷酸序列相比,其同源性在97.8%～98.9%,与人巨细胞病毒分离株的同源性在32.0%～43.6%,表明gB基因在同种动物间比较保守。在系统进化树中,GX株与其他猪巨化细胞病毒株亲缘关系较近,属于同一个分支,而与人巨化细胞病毒差异较大。     

山羊痘病毒疫苗株与野毒株PCR—RFLP鉴别方法的建立及应用

为了建立区分疫苗株与广西分离株的检测方法,根据GenBank上的山羊痘病毒序列设计1对引物,用来扩增山羊痘病毒P32基因,通过对国内疫苗株及6株广西分离株的P32基因进行克隆、测序比较发现,所有广西分离株核苷酸651位的碱基全部由T变为C,647位～652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA,多了1个限制性内切酶Bsp 1407Ⅰ位点,因此用特异性引物扩增出739bp的目的片段后,再用限制性内切酶BsP1407 Ⅰ进行酶切分析。疫苗株可以切成135hp和604bp3个片段,广西分离株可以切成135、226、378bp3个片段。结果表明,所建立的PCR—RFLP方法可以区分疫苗株和广西分离株。     

山羊痘病毒疫苗株与野毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立及应用

为了建立区分疫苗株与广西分离株的检测方法,根据GenBank上的山羊痘病毒序列设计1对引物,用来扩增山羊痘病毒P32基因,通过对国内疫苗株及6株广西分离株的P32基因进行克隆、测序比较发现,所有广西分离株核苷酸651位的碱基全部由T变为C,647位~652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA,多了1个限制性内切酶Bsp1407Ⅰ位点,因此用特异性引物扩增出739 bp的目的片段后,再用限制性内切酶Bsp1407Ⅰ进行酶切分析,疫苗株可以切成135 bp和604 bp 3个片段,广西分离株可以切成135、226、378 bp 3个片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗株和广西分离株。     

2株鸭瘟病毒强毒株的分离鉴定

通过鸭胚接种,从山东和安徽两地疑似鸭瘟临床病例中分离鸭瘟病毒,分别命名为SD株和AH株。根据鸭瘟病毒疫苗株UL26-UL30的基因序列,设计引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增UL27(gB)的全基因,并对扩增的片段进行测序。结果表明,扩增片段包括完整的gB基因,长度均为3 003 bp,2株鸭瘟病毒分离株与鸭瘟病毒疫苗株的gB基因同源性均为99.8%,并且分别发生4个和2个氨基酸的变异。2分离株无血凝特性,鸭胚半数致死量DELD50分别为10-4.5/0.2 mL和10-4.35/0.2 mL,动物回归试验可致15日龄雏鸭死亡,鉴定为鸭瘟病毒强毒株。     

表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建

本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA（558 bp），用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物，回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中，获得了转移载体pPgG-PrM，并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明：与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较，PrM基因的同源性为100％。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^＋突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／PrM^＋，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗株糖蛋白gB基因序列比较分析

根据已经发表的鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）SA2的株的gB基因序列,设计了1对引物,通过PCR扩增了ILTV王岗株的gB基因,并克隆到pUC119质粒的EcoR I位点中,经酶切鉴定证实后,进行了序列测定。结果表明,gB基因长2619bp,包含完整的阅读框架。序列比较分析表明,ILTV王岗株的gB基因核苷酸序列与英国的Throne 882和美国的6322个强毒株的gB基因序列完全一致,而与澳大利亚SA2疫苗株gB基因核苷酸同一性为99.8%,氨基酸的同一性为98.4%。与澳大利亚SA2疫苗株gB基因核苷酸和氨基酸序列比较发现,ILTV3个强毒株（王岗株,Throne 882株和632株)gB基因的核苷酸序列在第89位上均缺失1个碱基G,而在第102位核苷酸处又插入了1个碱基A,从而引起了在氨基酸序列中第29～32位5个氨基酸的移码突变。此变异是否与病毒的毒力有关尚待进一步研究。     

猪瘟病毒野毒株与疫苗株酶切检测方法的建立、优化及应用

为有效鉴别猪瘟病毒强毒株(Shimen)与弱毒疫苗株(HCLV),根据GenBank上已发表的猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因高度保守区设计一对特异性引物,在其跨越区内部有Shimen株独有的限制性内切酶Bgl Ⅱ酶切位点,采取酶切RT-PCR产物的方法鉴别Shimen株和疫苗株,同时对该方法的特异性和敏感性进行检测。结果表明,应用该方法从Shimen株和疫苗株中均能扩增出一条大小为750 bp的特异性片段,疫苗株的RT-PCR产物不能被Bgl Ⅱ酶切,Shimen株的RT-PCR产物则被酶切为大小分别为520和230 bp的两条带。此方法可扩增猪瘟病毒的E2基因保守片段,对病毒RNA的最小检出量为3.96×10^-4 μg/mL。采用此方法检查了30例临床疑似猪瘟病料,结果3例感染猪瘟病毒强毒,21例为猪瘟弱毒疫苗株,其他为猪瘟阴性。     

应用RT—nested PCR检测猪流行性腹泻病毒的研究

将猪流行性腹泻病毒分离株HLJ02，经过胰酶处理后，在Vero细胞上增殖。利用Gen-Bank中的基因序列设计合成了2对M基因引物。应用RT-PCR和RT-nested PCR检测分别扩增出HLJ02的854bp的M全基因片段和412bp的M基因部分片段，而在猪传染性胃肠炎病毒中和Vero培养液中未扩增出上述产物。结果表明，RT-nested PCR检测可用于检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因片段的克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计合成一对引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序.结果显示扩增产物为300bp,与预期的目的片段大小一致,经PCR、酶切反应鉴定后克隆到pGEM-Teasy载体中,核苷酸序列经BLAST软件分析表明:番鸭呼肠孤病毒MW9170株S1基因的目的片段与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为91.7%,与鸡关节炎病毒S2基因同源性为68.7%,结果提示番鸭呼肠孤病毒MW9710株与鸡关节炎病毒亲缘距离较远.     

重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化

参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。     

鸡传染性喉气管炎病毒疫苗株gB基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列，设计了一对引物并以ILTV基因组为模板，经PCR特异性扩增出ILTV疫苗株的gB基因，基因产物大小为2．62kb，与设计相符，并对其进行了序列测定。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测及其序列分析

根据猪链球菌2型的溶血素基因合成了一对可扩增长度为1496bP目的片段的引物，建立了检测溶血素基因的PCR方法。该方法对猪链球菌2型参考株SS2—N株的检测结果为阳性，对马链球菌善疫亚种(C群)参考株ATCC35246、分离株SESZ—Y、SESZ—T、SESZ—C和猪葡萄球菌、大肠埃希氏茵的检到结果均为阴性；用EcoR I内切酶进行酶切．获得了与预期结果一致的863bP和633bP的2个片段。经对SS2—1株的PCR产物进行测序及序列分析，表明其与1933株、P1／7株的核苷酸同源性分别为99．7％和100％。     

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。     

胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定

用PCR法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)7型的DNA提取物中扩增出大小为2873bp的APXⅡA基因片段；将PCR产物重组到质粒载体pMD18-T中，并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明，克隆片段为完整的目的基因，该片段的核苷酸序列与国外分离株M30602的同源性达99．7％。     

RT-PCR方法快速诊断猪传染性胃肠炎

根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）标准毒株（Purdue-115）的ORF6（N基因）的基因序列，设计俣成了一对引物Li01/Li02用反转录聚俣酶链反应（RT－PCR）技术对发病猪的粪便进行检测。结果得到与预期大小相一致的约1174bp(N基因）的PCR产物，与从参照毒株TGEV TH－98扩增出的片段大小相一致。进一步用限制性内切酶进行分析，发现从发病猪火花名扩增出的N基因与参照毒株TH－98株具有相同的限制性内切酶图谱，从而证实本病例致病病毒为TGEV。     

鹅细小病毒主要结构蛋白VP3基因的克隆与序列分析

将GPV H2分离株接种于13日龄非免疫鸭胚，收集接毒后3－7日死亡鸭胚的尿囊液。纯化病毒，通过PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，经酶切鉴定后直接与pMD 18-T质粒载体连接，转化感受态大肠杆菌TG1。提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。结果表明；鹅细小病毒H1分离株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸，与国外已发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列同源性为98．5％，氨基酸序列同源性为98．3％，表明这二个毒株亲缘关系相近。     

猪巨细胞病毒(PCMV)四川株gB基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)gB基因的核苷酸序列(GenBank登录号:FJ870563.1)设计1对引物,采用PCR方法从确诊为猪巨细胞病毒的阳性样品中扩增gB基因,将其克隆到pMD19-T载体上,转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒T-PCMV-gB,经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上gB相应序列进行同源性分析。结果表明,该基因片段长度为2580 bp,与其他参考株gB基因的核苷酸同源性达98.0%～99.6%;其推导的氨基酸序列与人疱疹病毒6型和7型比较分析结果显示,其同源性分别为42.9%～43.6%和40.5%～40.6%。这些氨基酸差异对病毒生物学特性的影响有待于进一步研究。