鸡肠炎沙门氏菌外膜蛋白F的原核表达及免疫原性分析

根据GenBank中收录的鸡肠炎沙门氏菌OmpF基因序列设计1对引物,以鸡肠炎沙门氏菌辽宁分离株基因组为模板,扩增鸡肠炎沙门氏菌OmpF基因,用IEDB Analysis Resource在线预测分析,该基因可能存在15个线性B细胞抗原表位;同时将该基因克隆至原核表达载体PGEX-4T-1中,构建重组表达质粒PGEX-4T-1-OmpF,转入大肠杆菌BL21中,获得OmpF重组蛋白。Western-blot检测结果表明,该重组蛋白的分子质量约为66 kD(含标签蛋白),能被鸡沙门氏菌阳性血清识别,初步证实该蛋白具有免疫原性,为鸡肠炎沙门氏菌亚单位疫苗的进一步研究和开发奠定了理论基础。     

迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA原核表达及其免疫原性研究

为研究迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌ompA基因,构建重组载体pET-32a-ompA,将其转化大肠杆菌BL21后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约58 ku;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌强毒株ET-13攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为55%。本研究克隆了迟缓爱德华菌ompA基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组OmpA蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。     

马耳他布鲁菌omp25的原核表达与免疫原性检测

为在大肠杆菌中表达马耳他布鲁菌omp25基因并鉴定重组蛋白的抗原性,从马耳他布鲁菌中用聚合酶链反应技术(PCR)扩增得到布鲁菌omp25基因片段,并将目的基因插入原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-omp25转入大肠杆菌Rosetta中表达,用SDS-PAGE和Western-blot检测表达蛋白。结果显示成功构建了重组质粒pET-32a-omp25,并在大肠杆菌Rosetta中获得了重组蛋白,重组蛋白与布鲁菌阳性血清发生特异性反应。表明重组质粒pET-32a-omp25可以在大肠杆菌Rosetta中成功表达,并且重组蛋白可与布鲁菌阳性血清发生特异性反应,说明该重组蛋白有良好的免疫原性,该研究为以后疫苗的研制及布鲁菌病的检测打下良好的基础。     

鸡肠炎沙门氏菌ompA基因的克隆与B细胞表位预测

根据Gen Bank中的鸡肠炎沙门氏菌ompA基因序列,设计了1对引物,成功克隆出鸡肠炎沙门氏菌ompA基因,扩增产物大小为1053bp。采用DNA Star Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对鸡肠炎沙门氏菌ompA基因的氨基酸序列进行了B细胞表位预测,为进一步研究鸡肠炎沙门氏菌表位疫苗和分子诊断技术的建立奠定基础。     

猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达及鉴定

为获得大量的猪瘟病毒重组蛋白抗原,本文构建了猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域原核重组表达质粒pET-32a(+)-ABCD,对该重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达产量进行了比较分析,并采用胶体金免疫层析和蛋白质免疫印迹鉴定重组蛋白的反应原性。结果表明重组质粒pET-32a(+)-ABCD在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中均可以获得可溶性表达,目的蛋白表达量分别占总蛋白量的比例为11.4%和19.7%,大肠杆菌Rosseta(DE3)作为表达宿主菌更高效,且重组蛋白具有反应原性。该研究为猪瘟病毒重组蛋白抗原的制备提供了参考。     

鸡干扰素-α基因原核表达载体的构建及高效表达

干扰素（IFN）-α因其具有很强的抗病毒活性而备受关注。本研究根据GenBank上公布的鸡IFN-α核酸序列设计1对引物,用PCR方法扩增出鸡IFN-α基因,并将其克隆到原核表达载体pET-32a及pET-30a-DsbA上,得到重组质粒pET-32a-IFN-α及pET-30a-DsbA-IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞,经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析,结果表明pET-30a-DsbA-IFN-α表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约40.4 ku,表达产物主要以包涵体形式存在,且表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。     

鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及生物学活性分析

通过PCR方法扩增不含信号肽的鸡GM-CSF成熟蛋白基因,克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,构建原核表达质粒p32GM-CSF,通过IPTG诱导重组鸡GM-CSF蛋白表达,经镍离子亲和层析纯化后,用MTT法检测表达重组蛋白的生物学活性,并制备兔抗鸡GM-CSF多克隆抗体。结果表明成功地构建了p32GM-CSF原核表达质粒,SDS-PAGE结果显示表达的重组蛋白约34 ku,主要以包涵体形式表达,纯化后得到高纯度目的蛋白。West-ern Blot结果表明,该重组蛋白能与制备的抗鸡GM-CSF抗体特异性结合。MTT试验证实,该重组蛋白具有明显增强鸡骨髓细胞增殖的生物学活性;这些研究结果表明,表达的重组chGM-CSF蛋白及其多克隆抗体拥有相应的生物学功能,这将为进一步研究鸡GM-CSF蛋白的生物学功能及其应用奠定基础。     

鸡膜联蛋白A2的原核表达与纯化

试验旨在对鸡膜联蛋白A2(ANXA2)基因进行原核表达与纯化。利用鸡ANXA2基因特异性引物从鸡卵泡细胞cDNA中扩增ANXA2基因,亚克隆至原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并分析重组蛋白的表达形式;利用含Ni2+琼脂球对重组蛋白进行纯化,并利用Western blot进行鉴定。结果显示:成功构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2,重组蛋白His-chANXA2在0.1 mmol/L IPTG、诱导表达5 h和30℃诱导温度条件下表达量高,其在上清和包涵体中均有表达,但主要以包涵体形式存在。利用含Ni2+琼脂球从诱导菌裂解物上清中得到了纯度较高的重组蛋白,Western blot检测到与预期大小相符的重组蛋白条带。研究结果为后续开展ANXA2调控鸡卵泡发育的分子机制研究奠定基础。     

鸡β-防御素在大肠杆菌中的高效表达及复性

鸡β-防御素(gallinacin-3,Gal3)是鸡体内重要的防御因子,本试验研究了鸡Gal3融合蛋白在大肠杆菌中高效表达的规律,并探索了重组蛋白质的复性工艺.结果表明,加入诱导剂后1h,开始有可检出量的重组蛋白质表达,2h的表达水平已接近最大量;化学诱导剂IPTG 0.2～1.2mol/L对重组蛋白的产量没有明显影响.经Lablmage软件分析,融合蛋白的产量可达菌体总蛋白的35%以上,且主要以包涵体形式存在.将所获包涵体用8mol/L尿素溶解后,分步稀释于含有氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的复性系统中,重组蛋白得到完全复性.12mg/L复性的重组鸡Gal3能抑制肠炎沙门氏菌的生长,24mg/L能抑制肠致病型大肠杆菌的生长.     

GST pull-down验证新城疫病毒基质蛋白与鸡importinβ1蛋白的相互作用

旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外的相互作用。根据NDV ZJ1株M基因和鸡importinβ1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importinβ1基因,将其分别定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)构建重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importinβ1,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,SDSPAGE检测重组蛋白的表达情况,并对包涵体重组蛋白进行变性和复性处理。然后以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白,His-importinβ1重组蛋白为猎物蛋白,利用GST pull-down技术验证M蛋白与importinβ1蛋白的相互作用。结果表明,成功构建了重组原核表达载体pGEX-6p-M和pET-32a-importinβ1,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得了正确表达。SDS-PAGE电泳检测显示GST-M重组蛋白主要以包涵体形式存在,而His-importinβ1重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白,将其作为诱饵蛋白,可以捕获并检测到His-importinβ1重组蛋白,但是GST标签蛋白不能结合His-importinβ1重组蛋白。利用GST pull-down技术证实了NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外具有直接的相互作用,这为深入研究importinβ1蛋白在NDV M蛋白细胞核定位的分子机制以及在NDV复制和致病中的作用奠定了基础。     

猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A的克隆和原核表达

原核表达猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A(catabolite control protein A,ccpA)并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。采用PCR方法,扩增ccpA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21中进行诱导、表达和亲和层析纯化;经Western blotting初步评价ccpA的抗原性。重组原核表达质粒pET-28a-ccpA经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约38000,能被相关抗体所识别。因此,能成功在大肠杆菌中表达猪链球菌2型ccpA,为猪链球菌2型相关调节蛋白的免疫学研究奠定基础。     

传染性支气管炎N基因克隆及在大肠杆菌中的可溶性表达

核衣壳蛋白(N)是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的重要结构蛋白。根据GenBank报道的IBV的M41株的N基因序列设计一对引物,从提取的M41株的RNA中利用RT-PCR技术扩增获得了约1.23kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD18-T,经测定核苷酸序列证实N基因扩增正确,表明已成功构建pMD18-T-N。再将pMD18-T-N用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pET-32a,转化入大肠杆菌Rossetta中,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳,电泳结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白,Western-blotting检测表明N蛋白可与相应IBV病毒抗体发生特异性的反应,表明N蛋白有一定的生物活性,可为用于生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础。     

牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。     

鸡传染性法氏囊病病毒BC6/85株VP2基因的原核表达、纯化及鉴定

为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。     

含有分子内佐剂的CIC蛋白表达及免疫活性初步研究

为了研究含有分子内佐剂的CTB-IsdBid-Clfais（CIC）蛋白表达及其免疫活性,试验采用重叠PCR方法将分子内佐剂CTB与IsdBid-Clfais基因串联,并将CTB-IsdBid-Clfais（CIC）插入到表达载体pET-32a（+）中,构建pET-32a（+）-CTB-IsdBid-Clfais重组质粒,将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中表达目的蛋白CIC,利用Western blotting方法对其进行鉴定,并以ELISA方法检测CIC蛋白的免疫活性。结果发现,试验成功扩增了2 072 bp的目的基因CIC,并将CIC正确连接到pET-32a（+）载体上,构建了pET-32a（+）-CTB-IsdBid-Clfais重组质粒;Western blotting结果证实,该重组质粒能够在大肠杆菌BL21感受态细胞中正确表达CIC蛋白,分子质量大小为95.9 ku;ELISA结果显示,CIC试验组与IsdBid、Clfais蛋白组间均无显著差异（P>0.05）,与BSA组间差异极显著（P<0.01）。综上所述,本研究成功构建了pET-32a（+）-CTB-IsdBid-Clfais重组质粒,该质粒在大肠杆菌BL21中成功表达了CIC蛋白,且CIC能与IsdBid、Clfais免疫小鼠血清发生反应,具有较强的免疫活性。     

Study on Expression and Preliminary Immunocompetence of CIC Protein Containing Molecular Adjuvants

To express CTB-IsdBid-Clfais(CIC) protein and evaluate its immunogenicity, CTB (as a molecular adjuvant) could be tandem linked with IsdBid-Clfais gene by the overlapping PCR method, then CTB-IsdBid-Clfais(CIC) was inserted into pET-32a(+) vector to construct recombinant plasmids pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais. The recombinant plasmids pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais were transformed into Escherichia coli (E.coli) BL21 to express the CTB-IsdBid-Clfa(CIC) protein, the CIC expression protein and its immune activity were detected by Western blotting and ELISA,respectively. The results showed that the length of CIC gene were 2 072 bp, and CIC was correctly inserted into the pET-32a(+) plasmids, the pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais recombinant plasmids were successfully constructed. Western blotting result confirmed that the molecular weight of CIC proteins was 95.9 ku, which were correctly expressed by E.coli BL21 with pET-32a (+)-CTB-IsdBid-Clfais plasmids. ELISA results showed that there was no significant difference among the CIC, IsdBid and Clfais protein groups (P>0.05), and there was extremely significant difference between CIC and BSA protein groups (P<0.01). In conclusion, the pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais recombinant plasmids were successfully constructed, CIC proteins were correctly expressed, and were able to react with serum from mice immunized with IsdBid and Clfais,respectively,therefore, CIC proteins had strong immune activity.     

H6N6亚型禽流感病毒N6基因的原核表达与多克隆抗体制备

为表达H6N6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（NA）蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列（登录号：MG434500）设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380 bp,可编码459个氨基酸,其中175－207 bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 380 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70 ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70 ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆、表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌的外膜蛋白ompP2基因,序列测定结果表明扩增片段全长1 188bp。将扩增片段插入表达载体pET-32a,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果证实重组融合蛋白约为60 000,West-ern-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白ompP2作为抗原,建立副猪嗜血杆菌的抗体间接ELISA检测方法。通过试验确定最佳反应条件为抗原包被质量浓度4.75mg/L,4℃包被过夜,待检血清的稀释浓度为1∶40,阳性判断标准为D630大于0.383。特异性和重复性试验表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于副猪嗜血杆菌的检测。     

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段的克隆及原核表达

根据GenBank公布的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1蛋白羧基端序列(AF290001.1),设计合成2对特异性引物,采取套式PCR方法,以肺炎支原体培养物中提取的DNA为模板,扩增肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,将其克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a/P1(3 802～4 695),转化大肠埃希菌BL21-gold,测序验证后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE表明重组蛋白表观分子质量与预期一致,可溶性表达产物经Western blot证实重组蛋白具有免疫反应性。     

猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达

Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据。本研究根据PCV2 TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2 TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48 ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应。本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2 Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础。