猪传染性胃肠炎病毒NSP5蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)NSP5蛋白的单抗隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以原核表达并纯化的重组NSP5蛋白(r NSP5-GST)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛出一株稳定分泌抗TGEV NSP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(5C3)。MAb亚类鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶6 400和1∶105。Western blot鉴定表明该MAb能够识别原核及真核表达的NSP5重组蛋白。利用肽扫描法鉴定显示,该MAb识别的抗原表位为286EFTPTEVIR QMYGVN300。本研究制备的MAb及其抗原表位的鉴定,为TGEV NSP5蛋白结构和功能的研究奠定了基础。     

A组猪轮状病毒NSP3蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备A组猪轮状病毒(Po RV)非结构蛋白NSP3的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究将原核表达、纯化的重组NSP3蛋白(r NSP3)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA法筛选,得到一株能够稳定分泌抗Po RV(G9)的杂交瘤细胞株(5B8)。MAb鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1型;MAb细胞培养上清液效价为1∶103,western blot及间接免疫荧光结果表明该株MAb能够与Po RV反应。对NSP3蛋白进行截短表达,采用western blot试验确定所获得的MAb识别的抗原表位区域序列为290QDYD RTFL297。该MAb的制备为进一步研究NSP3蛋白的结构和功能奠定了良好的基础。     

H5亚型AIV HA抗原表位重组蛋白McAbs的制备及应用

目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。     

猪传染性胃肠炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白的单克隆抗体(MAb),试验利用原核表达融合蛋白His-M免疫7周龄雌性Balb/c小鼠,以PK-15细胞培养病毒液作为检测筛选抗原,并采用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果表明:获得2株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株(2G1、2G2),经检测其细胞培养上清液和诱导的小鼠腹水抗体效价分别可达到1∶3 200和1∶1×10~5;连续培养15代及液氮冻存后复苏,抗体效价稳定;单克隆抗体亚型鉴定均为IgG1,轻链均为k链;MAb能够特异性识别TGEV。     

1株抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白的抗原表位,本研究通过原核表达N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合和亚克隆技术,筛选出1株稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体的杂交瘤细胞9B4。经鉴定单克隆抗体9B4的亚型为IgG1型,轻链为Kappa链。腹水抗体ELISA效价为10~6以上。ELISA、Western blot和免疫荧光鉴定结果显示该单克隆抗体反应原性和特异性良好。利用噬菌体展示技术对单克隆抗体9B4进行抗原表位鉴定,获得4个N蛋白的模拟抗原表位(C11、C12、C14和C26)。随后分别以噬菌体阳性克隆为模拟抗原,对临床PEDV血清样品进行检测,发现其均能与猪PEDV阳性血清发生特异性结合,而与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)阳性血清不反应,说明本研究获得的N蛋白模拟表位可用于PEDV抗体的检测,有助于PED流行病学调查和PEDV疫苗免疫效果的评价。     

鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定

拟制备针对鸡传染性贫血病毒（CIAV）VP2蛋白的单克隆抗体（mAb）,为CIAV的诊断和病毒生物学特性研究提供有用制剂。以PCR技术扩增CIAV VP2基因并克隆到原核表达载体pET-32a中,经IPTG诱导表达。以原核表达的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术研制并筛选分泌抗CIAV VP2蛋白mAb的阳性杂交瘤细胞;采用截短表达CIAV VP2基因方法鉴定mAb识别的抗原表位。结果显示：成功获得了1株能稳定分泌抗CIAV VP2蛋白mAb的杂交瘤细胞株,并命名为CIAV-VP2-4A12;亚类鉴定结果表明,该mAb重链为IgG₁型,轻链为kappa链;Western blot结果显示,该mAb可以识别大肠杆菌,Sf9细胞和转染pCAGGS-VP2-Flag的DF1细胞中表达的VP2蛋白。使用原核表达截短蛋白进行表位鉴定,发现该mAb识别抗原表位序列是¹⁵⁵KTVRW¹⁵⁹,序列比对发现该表位在CIAV中高度保守。本研究成功制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性mAb,并精确鉴定了其识别表位,为VP2蛋白功能的研究以及CIAV的诊断方法研发提供了有效工具。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB单克隆抗体的制备及其对应表位区分析

为鉴定口蹄疫病毒(FMDV)的非结构蛋白3AB的抗原表位,本研究以原核表达并纯化的FMDV 3AB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,获得6株能够稳定分泌抗3AB蛋白特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞.这6株MAbs亚类鉴定均为IgG1型,轻链均为K链.间接免疫荧光试验结果表明,这6株MAbs均能够识别FMDV 3AB蛋白.采用制备的MAb对分段表达的3AB蛋白进行western blot分析,结合位点分别位于3AB的第aa 55～aa 70、aa 64～aa 79、aa130～aa145区段.该结果为进一步探索3AB蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础.     

猫杯状病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白VP1的单克隆抗体(MAb)及鉴定其表位,本研究以原核表达的重组VP1-E蛋白(aa427~aa524)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合制备杂交瘤细胞;以纯化的FCV-2280病毒粒子作为检测抗原,采用间接ELISA检测方法筛选杂交瘤细胞株,分析杂交瘤细胞所分泌的抗体亚型、中和活性及所识别的抗原表位等。结果表明,获得两株稳定分泌抗FCV VP1-E MAbs的杂交瘤细胞E2F1和E2F6,抗体均为IgG1亚型,轻链为κ链。杂交瘤细胞分泌的抗体无中和活性。Western blot结果显示,两种抗体可以特异性识别FCV-2280,表明其针对的抗原表位为线性表位。两株MAb识别VP1-E序列均为~(467)YICGSLQRAWG~(477)。生物信息学分析显示该抗原表位在FCV VP1蛋白中相对保守。该MAb为建立特异性强、灵敏度高的FCV的检测方法奠定基础。     

抗禽白血病病毒p27蛋白线性抗原表位的鉴定

为鉴定禽白血病病毒(ALV)p27蛋白中的线性抗原表位,本研究以原核表达的重组p27蛋白免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接ELISA方法筛选纯化获得一株能够稳定分泌特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。Western blot试验结果显示,该MAb可以识别ALV的群特异性抗原p27蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,MAb与A、B和J亚群ALV均呈阳性反应。对p27蛋白进行截短表达,利用western blot和间接ELISA进行表位鉴定,确定了MAb所识别的抗原表位位于129LVAITASALQAFRE142。氨基酸序列比对结果显示,本研究所鉴定出的p27表位在A、B和J亚群ALV之间高度保守。本研究为ALV检测方法的建立及其免疫学功能的研究提供了有利的工具。     

抗禽流感病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步分析

为制备抗禽流感病毒(AIV)NS1蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位鉴定,本研究以原核表达并纯化的NS1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,制备的D7和D9 2株能够稳定分泌抗NS1蛋白MAb的杂交瘤细胞,亚型鉴定均为IgG1型,轻链均为k链.Western blot鉴定表明,这2株MAbs均能够识别NS1重组蛋白.间接免疫荧光鉴定表明,这2株MAbs均能够识别真核表达的NS1蛋白.利用噬菌体展示技术得到D9对应的短肽WNLNTV,与NS1蛋白aa 182～aa 187基本匹配,提示182WNDNTV187为NS1蛋白的一个线性表位.该结果为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础.     

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D 蛋白免疫 BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明, S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示, 腹水的抗体效价达到了1∶1 000 000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV) 5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与 PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究 PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。     

伪狂犬病病毒gB蛋白抗原表位基因串联构建及原核表达

本试验通过自行设计两段引物,利用重叠延伸PCR方法,将伪狂犬病病毒(PRV)gB基因两段优势抗原表位序列串联,克隆至pMD18-T载体,测序正确后双酶切连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒;重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白表达情况。经检测,诱导后的重组蛋白获得表达,重组蛋白大小约为54ku,其中串联蛋白大小约为34ku。该重组蛋白可与伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体发生特异性反应,表明重组蛋白的抗原性良好。     

猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达

Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据。本研究根据PCV2 TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2 TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48 ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应。本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2 Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。     

猪流行性腹泻病毒荧光抗体的制备及应用

本研究旨在建立一种可辅助猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离鉴定的直接荧光抗体检测方法。借助基因工程技术融合表达PEDV S1基因中和抗原表位区域（COE）,层析柱法纯化兔源免疫球蛋白IgG,搅拌法标记荧光素。通过Western blotting和动物免疫试验测定表达融合蛋白的抗原性,间接ELISA方法测定免疫后的抗体效价,直接免疫荧光法测定标记荧光抗体的特异性,梯度稀释方法测定标记抗体的最佳工作浓度。结果显示,本研究成功将423 bp的S1基因中和抗原表位COE进行融合表达,表达蛋白大小约40 ku,蛋白命名为pGEX-6P/COE;Western blotting检测结果表明,融合蛋白具有良好的反应原性;ELISA检测结果显示,免疫后35 d的血清抗体效价达1：25 600;与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪瘟病毒（CSFV）及猪细小病毒（PPV）等均无非特异性反应,标记的荧光抗体具有良好的特异性,最佳工作稀释度为1：32~1：64。综上所述,本试验制备的直接免疫荧光抗体可用于细胞平台上的PEDV快速检测,能直观地提供相关检测数据,对于病毒分离过程的取舍具有重要指导意义。     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白原核表达和间接ELISA检测方法的建立

试验构建了pET28a-TGEV-N重组表达质粒,完成TGEV N蛋白的表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,表明表达产物N蛋白可被猪TGEV阳性血清识别。用TGEV N蛋白作为诊断抗原,建立了检测TGEV血清抗体的间接ELISA检测方法,该方法批内、批间重复试验变异系数均小于5%;检测血清的特异性为100%,假阳性率为0,假阴性率为5%,与7种常见猪病血清无交叉反应。针对临床血清,用该方法检测结果与中和试验结果相比,符合率为100%。该方法能够快速、有效地检出TGEV抗体,重复性和特异性好,为标准化诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

Prokaryotic Expression and Development of an Indirect ELISA Detection Method of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus N Protein

In the study,the recombinant expression plasmid pET28a-TGEV-N was constructed,and expression and purification of the TGEV N protein was completed.Through SDS-PAGE and Western blotting analysis,the N protein could be identified by transmissible gastroenteritis virus (TGEV) positive serum.Using the TGEV N protein as diagnosis antigen,we established an indirect ELISA method for detecting TGEV serum antibodies.The coefficients of variation of intro-batch and inter-batch duplicability test were less than 5%.The specificity was 100%,and the rate of false positive and the false negative rate were 0 and 5%,respectively.No cross reactions with seven porcine diseases positive serum were detected.Using this method,the clinical serum samples were detected.The results showed 100% coincidence rate compared with neutralization test.The method could detect TGEV antibody quickly and effectively,and had good repeatability and specificity,which laid the foundation for the development of standardized diagnostic kits.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2抗原表位区的原核表达及免疫原性分析

试验旨在表达纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2重组蛋白。利用PCR技术扩增获得大小为750 bp的NSP2 226－475位氨基酸编码序列,然后将该序列亚克隆到pET-28a（+）表达载体上,通过pET-28a（+）表达载体在大肠杆菌Rosetta-gami 2（DE3）pLys中得以表达,获得大小为29 ku的重组蛋白,对重组蛋白诱导时间进行优化,SDS-PAGE显示重组蛋白在37 ℃经1 mmol/L IPTG诱导8 h时表达量最大,免疫印迹结果证实表达的蛋白能被PRRSV阳性血清识别,具有良好的免疫原性。本研究成功表达纯化了NSP2重组蛋白,为目标蛋白作为包被抗原建立检测PRRSV血清抗体的ELISA方法奠定了基础。     

产气荚膜梭菌B型C58-1株β1毒素基因的克隆表达

利用PCR技术,从B型产气荚膜梭菌中国标准株C58-1株扩增出β1毒素基因,连接pMD18-T 载体筛选阳性克隆,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收927 bp的β1毒素基因片段,将其定向克隆到载体pET-32a中,获得重组质粒pETβ927。将pETβ927转化至受体菌BL21(DE3)中,其表达产物经His-Trap FF预装柱纯化、SDS-PAGE 检测目的蛋白大小和分布及Western blotting检测其反应原性。结果表明,完整的β1毒素基因大小为1 011 bp,与GenBank发表的B型和C型产气荚膜梭菌β1毒素蛋白序列同源性达99.4%以上;SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白大小为 54 ku,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但以包涵体为主。Western blotting检测结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体发生免疫反应,表明β1毒素蛋白具有较好的反应原性。     

Prokaryotic Expression and Immunogenicity Analysis of Epitope Domain of NSP2 of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

This experiment was conduced to express and purify the recombinant NSP2 protein of PRRSV. The NSP2 gene was amplified using PCR method, and then it was subcloned into pET-28a(+) vector and expressed in E.coli. The molecular weight of the recombinant protein was 29 ku. The result of SDS-PAGE indicated that the expression efficiency of the recombinant protein was induced by 1 mmol/L IPTG for 8 h at 37 ℃.Western blotting result showed that the recombinant protein had high immunogenicity and could be recognized with positive serum of PRRSV. In this study, we expressed and purified the recombinant NSP2 protein of PRRSV, and the results laid the foundation for the further development of ELISA methods coated with NSP2 protein.