H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

禽流感病毒单克隆抗体的研制及初步应用

接种H5N1亚型禽流感病毒(AIV)鸡胚尿囊液，经甲醛灭活后，差速离心提纯病毒，三次免疫BALB／c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓细胞SP2／0-Ag-14融合。用间接ELISA和血凝抑制(HI)试验筛选阳性杂交瘤细胞株。本研究共获14株能够稳定分泌特异性单克隆抗体(McAbs)的杂交瘤细胞株，其中McAb A6具有HI特性，并可以与重组鸡痘病毒表达的H5亚型AIV HA蛋白反应。用间接EHSA试验测定McAbs与125株AIV分离株的反应性。用反应谱广的McAbs(483和F2)进行交叉反应实验，确定了McAbs可用于夹心ELISA的最佳包被和酶标方式。以McAb483为基础建立的夹心ELISA对175株各亚型的AIV的阳性检出率在90％以上。     

抗H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及初步鉴定

利用纯化的H9N2亚型禽流感尿囊液病毒免疫原免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法检测培养上清是否对H5N1亚型AIV及NDV反应,筛选只针对H9N2亚型AIV的阳性细胞株,经克隆获得2株较高亲和力的杂交瘤细胞株,用其制备的腹水ELISA效价达到2×105。     

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)NP蛋白的单克隆抗体,将构建的重组表达质粒pET-30a-NP转化BL21细胞,经IPTG诱导表达、纯化后作为免疫原,免疫8周龄Balb/c雌性小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。通过ELISA方法、Western-blot方法进行筛选,获得3株杂交瘤细胞株,命名为3A6、2H12、5F7,并进行了培养特性、分泌抗体活性、分泌抗体亚类的鉴定。结果显示：3株细胞株连续传10代均稳定分泌单克隆抗体,分泌的单克隆抗体亚型均为IgG2b,轻链类型均为Kappa。制备并纯化了以上3株单克隆抗体,浓度分别为2.9、2.5、2.8 mg/mL,纯度不低于90%。West-blot检测,单抗与H7血凝抑制试验抗原、H5血凝抑制试验抗原、H9N2病毒能发生特异性反应,说明单抗具有广谱性,且与IBDV、REV、IBV、MDV、ALV、AE、ILT、NDV、EDSV等均无特异性条带出现,说明特异性良好。本研究制备的3株针对禽流感NP蛋白的单抗,具有较好的特异性、保守性和广谱性,为下一步开展AIV诊断试剂如IFA检测试剂盒、ELISA检测试...     

H5亚型禽流感单克隆抗体的研制及应用

以禽流感H5亚型病毒分别免疫BABL／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验(HI)和间接ELISA检测细胞上清液，结果获得了3株抗禽流感H5亚型病毒特异性单克隆抗体，分别命名为186，1D4，7D1；其中1D4株为抗禽流感H5亚型病毒血凝素特异性单克隆抗体细胞株．186株和7D1株为针对禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体细胞株。经3次亚克隆后，100％杂交瘤细胞保持了分泌抗禽流感病毒抗体的能力。这些单克隆抗体小鼠腹水ELISA效价为10^5，HI效价为2^11-12。研究结果表明，所有这些单克隆抗体仅与相应的禽流感病毒株发生特异性反应，而不与鸡新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、鹅副粘病毒等反应。所有这些单抗在禽流感诊断中将发挥重要作用。     

抗H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及初步鉴定

利用纯化的H9N2亚型禽流感尿囊液病毒免疫原免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法检测培养上清是否对H5N1亚型AIV及NDV反应,筛选只针对H9N2亚型AIV的阳性细胞株,经克隆获得1株较高亲和力的杂交瘤细胞株,命名为4E7,用其制备的腹水ELISA效价达到2×105,Western-blotting证明单抗4E7经鉴定为针对75KD血凝素的单抗,HI效价为1:27,且不与新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、传染性脑脊髓炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H5N1亚型禽流感病毒发生交叉反应,具有较好的特异性。IgG亚型为IgG1。     

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备H5N6亚型禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),采用纯化的H5N6 AIV免疫BALB/c鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法进行筛选,获得2株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为3D9和2B10。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞培养上清液抗体效价分别为1∶1×10~3和1∶1×10~4,腹水的抗体效价分别达到1∶1×10~5和1∶1×10~6; 3D9和2B10亚类鉴定重链为IgM,轻链为κ链; Western blot分析表明,2株杂交瘤细胞上清均能与不同的AIV感染的尿囊液在56 kD处发生特异性反应,并能与原核表达的重组NP蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验显示,2株单克隆抗体均能与不同的AIV感染的MDCK细胞产生特异性反应。以上结果表明,本研究针对H5N6 AIV的NP蛋白制备了2株单克隆抗体,且都具有较好的特异性、保守性和广谱性,为今后禽流感诊断方法的开发奠定了基础。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39特异性单克隆抗体的制备

为了制备乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位特异性单克隆抗体,将编码乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39的DNA序列进行人工合成,随后插入表达载体pGEX-6p-1的限制性酶切位点BamHⅠ与XhoⅠ之间,构建了表位肽与GST的融合表达质粒。该表住融合蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB／c小鼠,按常规方法进行细胞融合。以化学合成的E39表位多肽为抗原,对融合细胞上清进行间接ELISA筛选。结果,筛选出1株分泌E39表位特异性抗体的杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞分泌抗体能力稳定。经鉴定,该单克隆抗体亚型为IgG2b,轻链类型为κ链。结果表明,用表位融合蛋白为抗原可以制备表位特异性单克隆抗体。     

H9N2禽流感病毒核蛋白NP单克隆抗体的制备

为了了解抗H9N2禽流感病毒(AIV)单克隆抗体的确切用途,试验用纯化后的H9N2禽流感病毒免疫Balb/c小鼠,经细胞融合后再进行筛选。结果表明:获得2株能够稳定分泌抗H9N2 AIV的杂交瘤细胞株,分别命名为1E7和3D6,2株单克隆抗体的腹水效价分别为1∶25 600和1∶12 800;应用间接ELISA和间接免疫荧光检测显示,2株单克隆抗体均能与H9N2亚型AIV发生反应;进一步研究发现,3D6可以与H9N2 AIV中的NP蛋白结合,使得表达NP蛋白的MDCK细胞显现出绿色荧光。说明3D6是一株针对H9N2 AIV NP蛋白的单克隆抗体。     

禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的制备和鉴定

以常规方法纯化H9亚型禽流感病毒，制备了两株分泌抗禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞11A5和1182，其上清ELISA效价均为1：10^4，腹水效价为1：10^7和1：10^6，HI效价上清分别为8、7log2，腹水效价均为15log2。采用HI方法证明其对禽流感病毒H9亚型的特异性，通过Western blot方法证明两株单抗都针对H9亚型禽流感病毒HA1蛋白。     

H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的制备与鉴定

本研究用纯化的H9N2亚型禽流感病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得3株能稳定传代并分泌抗H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的杂交瘤细胞：3G8、2F6、5F2。间接ELISA方法检测,3株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达106以上。构建了真核表达载体pCAGGS-M1并转染于MDCK细胞,以用于腹水的Western blot和间接免疫荧光鉴定。间接免疫荧光结果表明,3株单克隆抗体皆与真核表达蛋白M1反应。这些单克隆抗体的制备为后期研究M1蛋白在流感病毒复制与出芽过程中的重要生物学功能奠定了基础。     

抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单克隆抗体的研制及鉴定

以抗H5亚型禽流感病毒（AIV）JSD株鸡胚尿囊液免疫8周龄BALB/c小鼠,第4次免疫后取其脾淋巴细胞与SP2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验（HI）对杂交瘤进行筛选,经3次亚克隆后,共获得4株针对血凝素（HA）蛋白的特异性单克隆抗体,分别命名为：2D2、2C8、3D3和3D11。该4株单抗的小鼠腹水的HI效价在2^13～2^15,ELISA效价为1.2×10^5～5.1×10^5。亚类鉴定结果表明,2D2和3D11属于IgG1,2C8属于IgG3,3D3属于IgG2a亚类;特异性试验结果表明,上述4株单抗仅与H5 AIV毒株发生特异性反应,而不与其他亚型AIV以及NDV、IBV和EDSV-76等病毒反应;鸡胚中和试验结果显示,4株单抗均具有较好的中和活性。本研究成功获得4株针对H5 AIVHA蛋白的特异性单抗,为临床H5 AIV的血清学监测及鉴定提供了必需的试剂。     

抗犬瘟热病毒重组核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组犬瘟热病毒(CDV)N蛋白免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术获得两株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为A_4C_6C_(12)和A_5B_8H_7。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10~6、1:10~5;亚类鉴定结果分别为IgG2a、IgG2b,轻链均为κ型;Western blot和ELISA分析结果显示2株单克隆抗体均能与重组N蛋白和CDV发生反应,而与犬细小病毒及犬腺病毒等无交叉反应;ELISA叠加试验的增值结果表明两株单克隆抗体识别的抗原位点不同。特异性抗CDV-rN的单克隆抗体的获得,为进一步用于临床诊断研究奠定了基础。     

抗酵母表达犬细小病毒蛋白VP2的单克隆抗体的制备和鉴定

以纯化的酵母重组表达的犬细小病毒VP2单位免疫BALB／C小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,通过ELISA方法筛选,获得4株能稳定分泌抗犬细小病毒CPV结构蛋白VP2的单克隆抗体杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体中,2株属于IgG2b亚类,2株属于IgG1亚类,其腹水效价可达到1：51200和1：204800,细胞培养上清液效价可达1：256、1：512。ELISA分析表明,这些单抗仅与CPV及其VP2发生特异性反应,而与CDV和CAV-1及CAV-2没有交叉反应;荧光免疫染色病毒检测进一步表明单克隆抗体的特异性效果好。这些特异性单抗的制备为建立有效的检测犬细小病毒感染奠定了基础。     

基于马赛克HA序列的H9亚型禽流感灭活疫苗的免疫效力分析

H9亚型禽流感在我国家禽中广泛流行,给养禽业造成巨大经济损失的同时,也严重威胁着公共卫生安全。H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）具有高度遗传变异性,导致流行株和疫苗株之间抗原匹配性差,从而影响疫苗的临床保护效果,急需研发一种高效、具有交叉保护性的通用型H9亚型禽流感疫苗。马赛克疫苗是针对遗传多样性病原体设计,通过整合所有抗原序列获得一条抗原表位覆盖最广泛的嵌合蛋白,并制备疫苗。本研究参考mosaic疫苗设计原则,设计、优化并合成了一条H9亚型禽流感病毒的mosaic血凝素（hemagglutinin,HA）基因序列,采用反向遗传操作技术,以H1N1亚型流感病毒PR8株为骨架,以mosaic H9HA序列替换PR8株的HA片段,获得重组病毒rPR8-HAm/H9。将其制备为灭活疫苗并免疫SPF雏鸡,监测抗体水平、攻毒保护效果,评价其交叉保护效果。结果表明,重组病毒rPR8-HAm/H9灭活疫苗免疫SPF雏鸡,可诱导机体产生较高水平的HI抗体和中和抗体,可显著抑制攻毒后病毒的脱落,对H9N2 AIV JM0305株的攻毒保护率为80%。rPR8-HAm/H9灭活疫苗可以对异源H9N2 AIV JM0305株产生较好的交叉攻毒保护,为研发基于马赛克技术的禽流感通用疫苗提供了前期基础。     

Detection of antibodies to the nonstructural protein (NS1) of avian influenza viruses allows distinction between vaccinated and infected chickens

To differentiate avian influenza virus (AIV)-infected chickens vs. chickens immunized with inactivated avian influenza virus, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed using a recombinant nonstructural protein (NS1) as the diagnostic antigen, which was cloned from an AIV H9N2 subtype strain isolated during the avian influenza outbreak of 2003-04 and expressed in Escherichia coli. Antibodies to the AIV NS1 protein was only detected in the sera of chickens experimentally infected with AIV but not in the sera of chickens immunized with inactivated vaccine. This ELISA is useful for serological diagnosis to distinguish chickens infected with influenza viruses from those immunized with inactivated vaccine.     

鸡SIgA重链单克隆抗体的制备及新城疫病毒和禽流感病毒特异黏膜SIgA检测方法的建立

为建立快速检测禽类黏膜组织中SIgA含量的方法,本研究原核重组表达鸡SIgA重链片段蛋白,纯化后免疫BALB/c鼠.以鸡胆汁中分离纯化的SIgA作为检测抗原,常规单克隆技术筛选出1株能够稳定分泌抗鸡SIgA单克隆抗体(MAb)的IgG2a、κ型MAb.经ELISA和western blot分析,所获得的1株MAb亲和力高、特异性强;采用生物素标记纯化MAb腹水IgG为检测二抗,以禽流感-新城疫重组二联活载体疫苗免疫SPF鸡为模型,初步建立了新城疫病毒和H5亚型禽流感病毒特异的黏膜SIgA间接ELISA检测方法.本研究为开展特异性家禽黏膜免疫机制的研究提供了重要技术手段.     

H6N6亚型禽流感病毒N6基因的原核表达与多克隆抗体制备

为表达H6N6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（NA）蛋白,并制备多克隆抗体,本试验根据GenBank中AIV N6基因序列（登录号：MG434500）设计特异性引物,对贵州地区分离的H6N6亚型AIV贵州株进行N6基因PCR扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,构建重组原核表达载体pET-32a-N6,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达His-N6重组蛋白,将诱导产物超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化,并利用SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行双重鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价。结果显示,AIV贵州株N6基因编码区长1 380 bp,可编码459个氨基酸,其中175－207 bp缺失33个核苷酸;重组质粒pET-32a-N6经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 380 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-32a-N6重组质粒;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,重组蛋白主要存在于沉淀中,以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为70 ku,与预期结果一致;纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在70 ku处出现条带,说明纯化的蛋白为重组蛋白pET-32a-N6,表达产物具有免疫学活性,包涵体经变性、复性处理,重组表达蛋白分别被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。间接ELISA检测其效价高于1∶3 200。以上结果表明,试验成功克隆、表达了H6N6亚型AIV的N6基因,所制备的N6蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,能被His抗体和兔源抗N6多克隆抗体所识别。     

H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定

以禽流感病毒A/Chicken/Hubei/327/2004(H5N1)免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验筛选细胞培养上清,采用有限稀释法对阳性孔进行克隆,3次克隆后获得7株能稳定分泌抗H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C4,1D4,1E12,2E11,4C12,4G2和5E12。细胞培养上清HI效价为24~27,腹水HI效价可达210~218。所有单抗与禽流感H7和H9亚型标准血凝抗原,新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒无交叉反应。在细胞上的中和试验显示具有较高的中和效价,获得的单克隆抗体可在禽流感流行病学的监测中发挥重要作用。