抗东方马脑炎病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合.以原核表达载体pET-30a表达并纯化的EEEV E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗EEEV E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为6F3、6F11、7C11、8B11.Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的4株MAbs均与EEEV呈阳性反应,而与西方马脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及登革热病毒1型～4型呈阴性反应.利用部分重叠的原核表达的短肽对E2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 6F11、7C11和8B11识别的抗原表位均为E-33 (321EGLEYTWGNHPPKRVW336),而MAb 6F3无短肽与其反应,推测可能为构象表位.本研究结果为建立EEEV型特异性检测方法、研究E2蛋白结构功能及该病的进一步防制奠定了基础.     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白。本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法获得1株特异性针对JEV E蛋白的杂交瘤细胞,命名为5D4,经测定5D4单抗亚类属于IgG2a,轻链为κ链。经Western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体可特异地与JEV E蛋白结合。结果表明,所制备的抗JEV E蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。     

猫杯状病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白VP1的单克隆抗体(MAb)及鉴定其表位,本研究以原核表达的重组VP1-E蛋白(aa427~aa524)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合制备杂交瘤细胞;以纯化的FCV-2280病毒粒子作为检测抗原,采用间接ELISA检测方法筛选杂交瘤细胞株,分析杂交瘤细胞所分泌的抗体亚型、中和活性及所识别的抗原表位等。结果表明,获得两株稳定分泌抗FCV VP1-E MAbs的杂交瘤细胞E2F1和E2F6,抗体均为IgG1亚型,轻链为κ链。杂交瘤细胞分泌的抗体无中和活性。Western blot结果显示,两种抗体可以特异性识别FCV-2280,表明其针对的抗原表位为线性表位。两株MAb识别VP1-E序列均为~(467)YICGSLQRAWG~(477)。生物信息学分析显示该抗原表位在FCV VP1蛋白中相对保守。该MAb为建立特异性强、灵敏度高的FCV的检测方法奠定基础。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位多肽序列鉴定及分析

为了对流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白抗原表位E19进行核心序列定位,本研究设计了一系列编码相互部分重叠短肽核苷酸序列,原核融合表达后经western blot分析,确定其抗原表位核心序列为150ENHGNYS156.该表位在乙型脑炎不同基因型的各种病毒株间为高度保守序列;根据JEV E19表位与同一血清群其他黄病毒之间的差异,在同源序列位置设计了系列突变短肽,融合表达后western blot分析的结果表明,其他黄病毒属病毒同源序列不能与抗JEV阳性血清反应.本实验结果表明JEV E蛋白抗原表位E19具有鉴别检测JEV与西尼罗病毒等其它黄病毒的意义.本实验为进一步研究E蛋白结构和功能以及建立乙型脑炎临床鉴别诊断方法奠定了分子生物学基础.     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白多表位肽在毕赤酵母中分泌表达及其免疫原性研究

为构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白多表位疫苗,本研究将人工合成的优化后的E蛋白多表位肽(MP)序列克隆入酵母表达载体p PICZα-A,构建分泌型重组酵母表达质粒p PICZ-MP,经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母X-33,阳性重组子经甲醇诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白(rMP)。通过测定rMP免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、中和抗体和CTL,以评价该多表位疫苗在小鼠模型上的免疫原性。结果表明:成功构建了表达JEV E蛋白多表位抗原的重组酵母菌株X33(pPICZ-MP),能分泌表达多表位肽r MP。纯化后的r MP免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应,其中和抗体水平、CTL活性均与活病毒疫苗组差异不显著(p0.05),且能保护小鼠免受致死量JEV的攻击。构建的JEV E蛋白多表位疫苗具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应,为流行性乙型脑炎多表位疫苗研制提供新的思路。     

乙型脑炎病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ结构域抗原表位鉴定

为鉴定乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白I,II结构域抗原表位,本研究设计了一系列针对E蛋白的I、II结构域(1aa～296aa)部分重叠短肽,分别进行GST融合表达,用JEV阳性血清进行western blot和ELISA反应性筛选,获得了5个线性抗原表位分别为:E1(1FNCLGMGNRDFIEGAS16)、E10-4(77TGEAHNEK84)、E11-2(83EKRADSS YVCKQ94)、E19(145GTTTSENHGNYSAQVG160)和E33(257SQEGGLHHALAGAIVV272)。除E10和E19外,其它表位均为第一次通过实验方法确定的。将这5个融合蛋白对小鼠进行免疫,获得了高滴度的针对5个融合短肽的抗血清,研究证明了这些表位具有良好的免疫原性。本研究为乙型脑炎特异性诊断试剂及表位疫苗的开发奠定了基础。     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列.设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证.经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性.对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体.本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据.     

禽传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体制备及其中和抗原表位的鉴定

为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位，本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠，经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效价为10⁶以上，Western blot和间接免疫荧光试验分析显示该单克隆抗体反应性和特异性良好。随后用8种基于S1分型的IBV毒株为试验毒株，同实验室已有的8株IBV S1单抗(1E9、1H1、1E4、3C6、3C7、2F3、2E5、4F9)共12株单抗进行气管环中和活性检测，发现S1蛋白单抗与8种S1亚型的毒株均有不同程度的中和作用。随后，在抗原表位和Western blot分析的基础上，鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域，获得了6个中和抗原表位，其中除⁴¹⁶IQTRTEP⁴²²表位，其他5个表位仍未有相关报道。本研究成功制备出4株特异性识别S1蛋白且具有中和活性的单克隆抗体，不仅丰富了IBV的单克隆抗体库，为今后研究IBV S1蛋白分子结构提供了关键生物材料...     

流行性乙型脑炎多克隆抗体的制备及其囊膜E蛋白ELISA方法的建立

为了建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)的检测方法,试验用纯化的乙型脑炎病毒免疫健康新西兰白兔制备多克隆抗体,并对多克隆抗体进行纯化和效价测定;以纯化原核表达的乙型脑炎重组结构蛋白(E蛋白)为包被抗原,通过对检测方法相关条件的优化,建立了检测乙型脑炎病毒抗体的间接ELISA方法。结果表明:该抗原不与猪其他疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;在批内重复试验中,变异系数小于10%。     

1株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位的鉴定

旨在研究非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白的B细胞抗原表位,本研究制备了p30蛋白的单克隆抗体(mAb),并以该单克隆抗体为工具进行B细胞抗原表位定位。首先,通过原核表达及Ni柱亲和纯化获得p30蛋白,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞制备,通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选出阳性杂交瘤细胞,并以细胞表达的方法制备单克隆抗体;采用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western blot)对单克隆抗体的特异性进行鉴定。利用IEDB表位预测软件对p30蛋白B细胞抗原表位进行预测,根据预测结果对CP204L基因进行截短表达,利用IFA、Western blot和iELISA对其抗原表位进行鉴定。最后,利用噬菌体十二肽库对制备的p30单克隆抗体进行4轮生物淘选,筛选多肽表位,并与上述基因截短表达筛选方法进行比对。特异性鉴定结果显示,该单克隆抗体能成功识别感染猪肺泡巨噬细胞的ASFV;基因截短表达筛选结果表明,其识别的抗原表位区域为⁸⁴M～K¹⁴²;噬菌体淘选试验结果表明,¹¹⁶TSSFETLFE¹²⁴为本试验制备的单克隆抗体所识别的p30蛋白抗原表位核心序列,该结果进一步缩小了表位分布范围。本研究制备了p30蛋白的1株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为血清学诊断试剂的研发和p30蛋白功能研究奠定基础。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

两种绿头鸭肌肉营养成分分析及评价

本试验旨在研究两种绿头鸭（白羽绿头鸭和绿头鸭）肌肉营养组成和价值,为绿头鸭肉产品的开发利用提供基础数据和理论依据。选择白羽绿头鸭和绿头鸭60只（每个品种各30只,公母各半）,依照国家标准测定胸肌粗蛋白质、粗脂肪、胆固醇含量及氨基酸、脂肪酸、微量元素和维生素的组成和含量,并对胸肌进行氨基酸评价及脂肪酸营养价值评价。结果显示,白羽绿头鸭肌肉粗蛋白质含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;两种绿头鸭肌肉中均检测到17种含量大于0.01%的氨基酸,其中白羽绿头鸭肌肉苏氨酸、组氨酸、丝氨酸和脯氨酸含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,赖氨酸、谷氨酸和精氨酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到13种含量均大于0.01%的脂肪酸,其中白羽绿头鸭硬脂酸和油酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到9种矿物质元素（钠、镁、钾、钙、锰、铁、铜、锌和硒）,两种绿头鸭差异不显著（P>0.05）;检测到8种维生素,白羽绿头鸭肌肉维生素B₁含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,维生素D和维生素E含量显著低于绿头鸭（P<0.05）。两种绿头鸭肌肉氨基酸比例接近世卫组织推荐的理想模式,富含人体所需的矿物质元素和维生素,具有广阔的开发利用前景。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

Comparison of four techniques of arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint of the horse

Reasons for performing study: Clinical experiences indicate that centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint is often unsuccessful. Objective: To determine the accuracy of 2 published and 2 unpublished techniques of centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint. Hypothesis: It was hypothesised that a drug can be administered into the lateral compartment of the femorotibial joint via a diverticulum of this joint that surrounds the medial aspect of the long digital extensor tendon and that this technique is more accurate than described techniques of centesis of this compartment. Methods: Twenty‐four stifles of 12 horses were divided equally into 4 groups and a radiocontrast medium injected into the lateral compartment of the femorotibial joint of each group using a hypodermic needle inserted: 1) caudal to the lateral patellar ligament and proximal to the tibial plateau, 2) caudal to the long digital extensor tendon and proximal to the tibial plateau, 3) between the long digital extensor tendon and bone of the extensor groove of the tibia or 4) directly through the long digital extensor tendon until it contacted bone. Twelve veterinary students who had no experience using any of these techniques performed the injections. Accuracy of each technique was determined by examining radiographs obtained after injecting the contrast medium. Results: The most successful technique for arthrocentesis was by inserting a needle through the long digital extensor tendon. This approach was successful in all attempted cases, whilst other techniques had lower rates of success. Conclusions: The lateral compartment of the femorotibial joint can be accessed accurately by inserting a needle through the long digital extensor tendon as it lies within the extensor groove. Other techniques may not be as accurate for clinicians inexperienced in arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint.     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

Prevalence of diseases of the spinal cord of cats

A retrospective review of records of 205 cats with histologically confirmed disease of the spinal cord was performed to identify the prevalence of disease in this nonrandomly selected population of cats. Clinical records were reviewed, and age, duration of neurologic illness, and clinical and histopathologic findings in cats with spinal cord disease were abstracted. Disease processes were classified into 7 categories and 23 groups. The most common diseases affecting the spinal cord of cats were feline infectious peritonitis (FIP), lymphosarcoma (LSA), and neoplasia of the vertebral column secondarily affecting the spinal cord. Information on age, onset and duration of clinical signs, and lesion localization at the postmortem examination in cats belonging to the 7 categories of disease were analyzed to create a practical list of differential diagnoses. Cats were also subcategorized into 3 groups based on their age at death. FIP was the most common disease of cats younger than 2 years of age. LSA and vertebral column neoplasia were the most common diseases affecting cats between 2 and 8 years of age. Vertebral column neoplasia was the most common disease affecting cats older than 8 years of age. Results of this histopathologic study showed that FIP and LSA were the most common disease processes affecting the spinal cord of cats. However, at least 21 other groups of diseases and their relative prevalence were identified.     

高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留量的不确定度评定

根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》建立了高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留测量的不确定度评定方法,评定过程包括建立测量程序、分析不确定度来源、对不确定度分量进行量化。将不确定度归类为两大类。随机效应导致的不确定度可以通过一系列具有统计意义的重复观测值进行A类评定;系统效应导致的不确定度通过各测量器具、设备的说明书、校准证书提供的参数进行B类评定。本方法鸡肉中土霉素残留量的相对合成标准不确定度约为3.9%。     

几个柑橘品种实生苗的抗旱性评价研究

以5个金柑属品种、枳壳、软枝酸橘及广西土柠檬实生苗为材料，进行复水成活率、旱害指数、叶片相对含水量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸等生理指标及隶属函数的综合分析，为柑橘抗性砧木品种选育提供参考。结果表明：胁迫20d复水后的成活率融安滑皮金柑和长寿金柑最高，为100%，软枝酸橘最低，为88.9%；随着干旱胁迫加剧，各品种的旱害指数呈上升趋势，长寿金柑的旱害指数最低，为0.25，软枝酸橘的旱害指数最高，为0.61；从叶片相对含水量的结果来看，长寿金柑的变化幅度最小，软枝酸橘的变化幅度最大，在第18d时分别为61.19%和37.85%；3种保护酶之间相互协同作用减轻植株受害程度，其活性变化幅度与丙二醛和脯氨酸的含量变化相似。利用隶属函数法综合分析，得出各品种的抗旱性强弱依次为长寿金柑>枳壳>融安滑皮金柑>融安金柑>山金柑>广西土柠檬>金枣>软枝酸橘。