口蹄疫病毒非结构蛋白3B真核表达载体的构建及表达

设计、合成FMDV非结构蛋白3B基因的PCR引物，并在引物5’端和3’端分别加入含BamH I和HindⅢ限制性酶切位点序列。以FMDV基因组PNA为模板，利用RT—PCR技术扩增3B基因，得到的基因片段经BamH I/HindⅢ双酶切后与转座载体pFASTBAC HTa连接，转化宿主菌DH10BAC，在含庆大霉索、卡那霉索、X-gal、IPTC的LB平板上37℃培养24h，提取白色菌落，从中提取重组Bacmid 3B，与脂质体共同转染昆虫细胞8f9，得到重组杆状病毒，病毒经传代扩增后感染High5细胞，表达目的蛋白——FMDV非结构蛋白3B。SBS-PAGE及Westem Blot结果显示，本研究成功构建了Bacmid-3B重组表达载体，并在昆虫细胞中表达了NSP—3B蛋白，该表达产物可与MDV感染的猪、牛血清产生免疫反应。     

猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究

探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。     

NSP—ELISA鉴别FMDV感染与免疫

利用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3ABC多肽作为抗原，建立了一种可区分FMDV感染与接种灭活疫苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验(I—ELISA)。通过对336份正常牛血清、508份注射疫苗牛血清、60份人工感染牛血清和58份豚鼠免疫血清的检测，确定了血清抗体阴性与阳性效价的临界值。试验证明，该方法简易、快速，灵敏度比VIAA—AGID高。     

口蹄疫病毒非结构蛋白2C基因主要表位区的表达及活性检测

根据测定的口蹄疫病毒（FMDV）2C基因序列,设计了一对特异性的表达引物,用于扩增2C基因5′-端174bp和3′-端279 bp连接片段,该区含有较丰富的B细胞表位编码序列。扩增片段通过NcoⅠ和SalⅠ酶切位点插入表达载体pET-30a。序列测定表明,目的基因片段连接正确,按正确的读码框插入表达载体中。重组表达质粒转化BL21（DE3）pLys,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting检测表明,2C基因主要表位区成功地在大肠杆菌表达,表达产物为约23 ku的融合蛋白,能够与FMDV感染动物血清发生特异性反应,而不与健康和灭活疫苗免疫动物血清反应。该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫转印（EITB）方法提供了所需的材料。     

口蹄疫非结构蛋白研究进展

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的在偶蹄动物间传播的烈性传染病,大多数发展中国家采取免疫接种来控制该病或建立无疫区,如何区分自然感染动物和免疫动物一直是控制和消灭该病的重要问题。大量的比较研究一致认为,以FMDV非结构蛋白(non-structural protein,NSP)为抗原,检测动物体内的NSP抗体是一种很好的区分感染动物和疫苗免疫动物的诊断方法。但因疫苗中残留的NSP或非特异性应激因素亦可引起假阳性反应,许多国家特别是泛美地区普遍联合采用3-ABC-ELISA或酶联免疫电转印试验(Enzyme-Linked Immunoelectrotransfer Blot Test,EITB),并得到了OIE的认可,已成功应用于南美国家口蹄疫扑灭计划。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术，扩增出口蹄疫病毒（FMDV）VP2基因，并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞，获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后，感染sf9细胞，表达VP2融合蛋白，分子质量为33ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体，通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定，说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达，且可以与牛抗。型FMDV血清发生特异性反应。     

口蹄疫病毒2C3AB基因的原核表达及ELISA方法的建立

口蹄疫病毒(FMDV)的2C蛋白中存在对自然感染和灭活疫苗免疫动物具有鉴别诊断意义的抗原表位。为建立一种敏感的血清学鉴别诊断方法,本研究截取FMDV 2C蛋白的C端B细胞表位较为富集的区域与全长3AB基因组合,经原核表达获得分子量约为44 ku的目的蛋白。Western blot分析表明,表达产物2C3AB与FMDV感染动物的阳性血清呈特异性反应。以纯化的目的蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,敏感性检测表明该方法比3ABC-ELISA具有更高的敏感性;同时检测猪圆环病毒、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒标准阳性血清均无交叉反应。批内和批间重复性试验显示,OD450nm值的变异系数小于9%。采用该方法检测不同背景的临床样品,并与3ABC-ELISA及进口试剂盒比较,总符合率分别为98.5%和90%。结果表明,该ELISA检测方法具有更高的敏感性和良好的特异性、重复性。     

O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性研究

试验旨在探索利用杆状病毒表达系统分泌表达小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV） F基因蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PPRV F基因克隆到已插入蜂毒信号肽（melittin）的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含F基因的重组杆状病毒DNA （F-Bacmid）,转染提取的F-Bacmid DNA至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒（F-rBac）,应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示,重组蛋白可被PPRV的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠试验结果显示,该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。本研究成功分泌表达了PPRV F蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为小反刍兽疫亚单位疫苗的研制奠定基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达

将牛源O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)China／99株非结构蛋白基因3ABC从pGEM-T-3ABC重组质粒中亚克隆到原核表达载体pTriEx-4Neo上,成功构建重组表达质粒pTriEx-3ABC。将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGE可检测到分子量约为59．1ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的31．4％。Western blotting分析证明表达产物能被FMDv阳性血清所识别。表达产物纯化后作抗原进行ELISA检测,结果表明,表达的蛋白显示特异的免疫学活性,并能区分自然感染动物和注苗动物。研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立自然感染动物和注苗动物的鉴别诊断方法提供了材料。     

共表达Asia1口蹄疫病毒P1-2A-3C基因和猪IL-18基因重组鸡痘病毒构建及表达

为构建Asia1型口蹄疫重组鸡痘病毒疫苗,采集口蹄疫发病牛的水泡液及水泡皮,用RT-PCR法扩增出Asia 1型口蹄疫病毒的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切连接获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。再将P1-2A-3C片段与pUTAL-IL18片段连接起来,构建鸡痘病毒中间转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-IL18。通过脂质体转染法,将pUTAL-P1-2A-3C-IL18与鸡痘病毒282E4株共感染染鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblasts,CEF）,通过BrdU三次加压筛选,筛选出重组鸡病毒株vUTAL-P1-2A-3C-IL18。经RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定,证明所筛选的1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C基因。本研究为研制安全、高效的亚洲Ⅰ型FMD重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白基因的克隆表达及免疫活性的研究

从口蹄疫病毒(FMDV)细胞培养物中提取总RNA,设计简并引物通过RT-PCR获得了完整的3ABC基因片段,将3AB基因和部分3ABC基因分别克隆到原核表达载体上构建重组表达质粒pET-3AB和pET-3ABC,然后转化BL21(DE3)plysS进行诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定.结果表明,3AB基因和3ABC基因可以在大肠埃希菌中高效表达,且表达产物能够与FMDV阳性血清产生免疫反应.进一步摸索重组蛋白的纯化条件,制备纯化蛋白,以纯化的表达产物为包被抗原进行间接ELISA检测,结果表明,重组蛋白具有特异的免疫学活性,能够用于鉴别FMDV感染动物血清和免疫动物血清.     

FMDV P1基因在重组PRV的表达及实验免疫研究

为获得FMDV的衣壳蛋白前体P1和P1与3C基因的重组伪狂犬病毒,并评价两重组病毒的免疫效果,进行了本项研究。将构建的重组转移质粒pIESZP1和pUTK3CP1,用脂质体转染预先感染0.1 MOI PRV的Vero细胞,经120 h培养收获病毒后,再分别用蓝斑筛选和BrdU加压筛选重组病毒3~5次。经过挑斑纯化、扩增培养后用PCR、IFA检测筛选表达的FMDVP1蛋白。用这2株病毒分别免疫BALB/c小鼠,通过SN和ELISA方法检测免疫小鼠的抗体水平。成功地获得了2株可以正确表达目的蛋白的重组伪狂犬病毒rPRVP1和rPRV3CP1。2株重组病毒均可诱导小鼠产生特异性抗FMDV抗体,两重组病毒各项免疫指标之间没有明显的差异。     

口蹄疫病毒多基因及猪α干扰素共表达载体的构建及其免疫豚鼠效果研究

为探讨口蹄疫病毒多基因及猪α干扰素（IFN-α）基因共表达真核质粒进入临床试验的可行性,本试验用PCR方法扩增了口蹄疫病毒P12A3C及部分2B基因（P12X3C）和猪IFN-α基因,克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,经双酶切鉴定后,将重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α转染BHK-21细胞中,观察目的基因的表达,并将重组质粒免疫豚鼠,检测豚鼠的血清抗体水平、中和抗体滴度及T淋巴细胞增殖情况。结果显示,经酶切鉴定及DNA序列分析成功构建了重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α,转染BHK-21细胞后,通过Western blotting、间接免疫荧光试验鉴定证实重组质粒能有效表达。ELISA结果显示,重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α比重组质粒pBudCE4.1-P12X3C能诱导机体产生更高水平的抗口蹄疫病毒的血清抗体,且中和抗体滴度也高于重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组。MTT法检测结果表明,重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α组淋巴细胞增殖可达15%,而重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组则为11%。攻毒后重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α组和灭活疫苗组保护率达100%,高于重组质粒pBudCE4.1-P12X3C组的80%。本试验成功构建了重组质粒pBudCE4.1-P12X3C-IFN-α,猪IFN-α作为佐剂可有效辅助口蹄疫DNA疫苗提高动物体内的免疫反应。     

Asia1型FMDV非结构蛋白3A基因的克隆、表达与抗原性鉴定

为了研究Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A的抗原性,试验对Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3A基因进行扩增、亚克隆及测序,将3A克隆至表达载体pET-32a(+)中,选取阳性克隆转化Rosetta(DE3)pLysS大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导表达和纯化3A蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-blot分析。结果表明:在大肠杆菌中成功地表达了3A蛋白,表达的目的蛋白能与Asia1型FMDV阳性血清发生特异性反应。说明非结构蛋白3A具有较好的抗原活性。     

O型口蹄疫病毒VP1嵌合基因的构建及原核表达

首先合成我国O型口蹄疫病毒2个疫苗毒株VP1基因的3个抗原袁位，与另外扩增的流行毒株VP1基因末端273bp片段相连,构建出O型VP1嵌合基因片段（VP1O）。然后，将VPIO基因连接到原核表达载体pET28a上，构建了重组表达质粒pET28a-VP1O，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达。SDS-PAGE电泳表明。VP1O基因在大肠杆菌中获得表达。Western blotting检测证实表达的VP1O蛋白具有良好的生物学活性。对表达蛋白通过包涵体洗涤的方法进行初步纯化，获得了较高纯度的VP1O蛋白。     

Immune responses of recombinant adenovirus co-expressing VP1 of foot-and-mouth disease virus and porcine interferon alpha in mice and guinea pigs

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious and economically devastating vesicular disease of cloven-hoofed animals. In this study, we constructed and characterized the immune responses and vaccine efficacy conferred by the recombinant adenovirus co-expressing VP1 of FMDV and porcine interferon alpha as fusion protein (rAd-pIFNalpha-VP1). Six groups of female BALB/c mice each with 18 were inoculated subcutaneously twice 2-week intervals with the recombinant adenoviruses. The results showed that the levels of humoral and cell-mediated immune responses in the group inoculated with rAd-pIFNalpha-VP1 were significantly higher than those in the group inoculated with rAd-VP1+rAd-pIFNalpha (P<0.05). Then four groups of guinea pigs each with six were inoculated two times at 2-week intervals intramuscularly with rAd-pIFNalpha-VP1, commercial inactivated FMD vaccine, wild-type adenovirus (wtAd) or PBS, and the protective efficacy of rAd-pIFNalpha-VP1 was determined. The results indicated that all the guinea pigs vaccinated with rAd-pIFNalpha-VP1 as well as inactivated FMD vaccine were protected from FMDV challenge, even though the levels of neutralizing antibodies (1:32-1:40) of the animals vaccinated with rAd-pIFNalpha-VP1 was lower than that in the group inoculated with inactivated FMD vaccine (1:64-1:128). It demonstrated that the newly recombinant adenovirus rAd-pIFNalpha-VP1 might further be an attractive candidate vaccine for preventing FMDV infection in swine.     

共表达O型FMDV衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达。应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行western blot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割。重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性。上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路。     

Immune responses of swine inoculated with a recombinant fowlpox virus co-expressing P12A and 3C of FMDV and swine IL-18

Two recombinant fowlpox viruses (rFPV-P1 and rFPV-IL18-2AP12A) containing foot-and-mouth disease virus (FMDV) capsid polypeptide, 3C coding regions of O/NY00 were evaluated to determine their abilities to induce humoral and cellular responses in the presence or absence of swine IL-18 as genetic adjuvant. The ability to protect swine against homologous virus challenge was examined. All swine were given booster vaccinations at 21 days after the initial inoculation and were challenged 10 days after the booster vaccination. Control groups were inoculated with wild-type fowlpox virus (wtFPV). All animals vaccinated with rFPV-P12A and rFPV-IL18-P12A developed specific anti-FMDV ELISA antibody and neutralizing antibody and T-lymphocyte proliferation was observed. Cellular immune function was evaluated via examination of IFN-gamma production in swine peripheral blood serum. The results demonstrate the potential viability of a fowlpox virus-based recombinant vaccine in the control and prevention of FMDV infections.