甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为口蹄疫病毒核酸疫苗递送载体的特性评价

旨在对制备的甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly （D，L-lactide-co-glycolide），PLGA]纳米微球作为口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）核酸疫苗递送载体进行评价。采用西佛碱反应和元素分析制备具有一定取代度的甘露糖修饰的壳聚糖衍生物（mannose modified chitosan，MCS），然后，经双重乳化挥发法制备得到甘露糖修饰的壳聚糖PLGA纳米微球（MCS-PLGA-NPs）。采用纳米粒径仪检测MCS-PLGA-NPs粒径分布和表面电势（zeta）、扫描电镜考察其形态、琼脂糖凝胶电泳观察其对质粒的吸附和吸附质粒后抵抗核酸酶降解能力、CCK-8法检测MCS-PLGA-NPs的细胞毒性、激光共聚焦观察巨噬细胞对MCS-PLGA-NPs-质粒DNA复合物的摄取、荧光显微镜和Western blot验证MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA在细胞中的表达。元素分析结果表明，成功制备了取代度为5%~10%的MCS。纳米粒径测定和扫描电镜结果表明，MCS-PLGA-NPs的zeta为正值、粒径分布均匀且形态规则呈球形。琼脂糖凝胶电泳结果显示，MCS-PLGA-NPs吸附质粒的能力随着其质量的增加而增强并且可以在一定程度上抵抗核酸酶降解质粒DNA。在细胞毒性试验中，不同浓度的MCS-PLGA-NPs与RAW264.7细胞共孵育24 h后，细胞存活率仍在85%以上。在细胞摄取试验中，用激光共聚焦显微镜可以明显观察到质粒DNA结合到纳米微球表面被RAW264.7细胞摄取。荧光显微镜和Western blot试验证明MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA可以在细胞中进行表达。综上表明，本研究成功制备了MCS以及具有递送核酸疫苗能力的MCS-PLGA-NPs，为FMDV核酸疫苗的递送研究提供了新的方向和见解，也为该递送载体携带特定抗原靶向抗原递呈细胞表面甘露糖受体以及应用于动物免疫的研究奠定基础。     

小RNA病毒基因组3'非编码区.结构与功能研究进展

小RNA病毒属于单股正链RNA病毒,包括肠道病毒属、鼻病毒属、心脏病毒属、口疮病毒属和肝病毒属等几个主要的属.口蹄疫病毒(FMDV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、丙型肝炎病毒(HCV)、脑心肌炎病毒(EMCV)是该科病毒的典型代表.小RNA基因组的末端具有非编码区(UTR),是病毒基因组复制的主要调控位点,3'非编码(3'...     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1上B细胞表位的筛选鉴定

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72 VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据.     

口蹄疫病毒抗原保护剂的筛选和优化

用三因素、三水平、双重复正交试验筛选出对口蹄疫病毒(FMDV)抗原保护效果较好的4号保护剂配方,该保护剂保存的病毒在37 ℃静置40 h和50 h后毒价TCID50分别为4.5和2.0,而对照组病毒则分别降至1.5和0.通过方差分析4号保护剂保存病毒测得TCID50极显著的高于1、3、5、6、7、8号,显著高于2、9号.保护剂配方优化试验结果表明,加该保护剂的病毒,分别于-20 ℃和4 ℃下保存90 d、120 d、150 d,其㏒TCID50分别为6.0、6.0、5.8和5.3、5.0、4.5,而未加保护剂的对照病毒则为5.8、5.3、5.0和5.0、4.5、4.3;FMDV 146 s抗原含量测定结果表明,分别于-20 ℃和4 ℃下保存150 d,37 ℃下保存40 h,测得结果分别为1.116 μg·mL-1、0.896 μg·mL-1、0.888 μg·mL-1,而未加保护剂的对照病毒则为0.846 μg·mL-1、0.802 μg·mL-1、0.307 μg·mL-1;反复冻融试验表明对照组冻融6次即为临界点, 病毒保护剂组达10次;通过对主要保护性抗原VP1基因,试验病毒株(O/NX/99/1)、对照病毒株(O/NX/99/2)测序比对,结果表明保护剂不会使病毒产生基因突变.试验结果说明该保护剂对FMDV有效抗原确实有较好的保护作用.     

口蹄疫A型病毒AF/72株标准乳鼠组织毒的研制

用口蹄疫A型病毒AF/72株的第3代乳鼠组织毒,通过乳鼠适应至6代,获得该毒株的乳鼠组织毒AF/72/MF6,经测定其LD50为10^-8.0·mL^-1;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其它6株口蹄疫A型病毒株比对,同源性大于85%;经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且经乳鼠中和试验证实该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng·mL^-1,远大于22 ng·mL^-1的国际标准。综合纯净性检验、特异性检验和146S含量测定结果,可确定AF/72/MF6为口蹄疫A型病毒AF/72株乳鼠组织毒的标准毒。     

口蹄疫病毒抗原保护剂的研究

[目的]研究几种(海藻糖、蔗糖、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮、硫脲、明胶、L-精氨酸、抗坏血酸)保护剂,为口蹄疫抗原保护剂配方的形成提供参考。[方法]用三因素、三水平、双重复正交试验方法筛选出了对口蹄疫病毒(FMDV)抗原保护效果最好的I(4#)保护剂配方,以加保护剂A(已申请专利)的病毒为对照,比较其在不同条件下的TCID50和146s抗原的含量。[结果]通过方差分析4#保护剂保存病毒测得TCID50极显著的高于1、3、5、6、7、8号,显著高于2、9。将4#保护剂加入被保存的病毒抗原中,分别于4℃下保存90、120、150 d,其logTCID50分别为5.3、5.0和4.5,而加保护剂A(已申请专利)的对照病毒则为5.0、4.5和4.3;在37℃下保存40、50和60 h,其logT-CID50分别为4.5、2.5和1.0;而加保护剂A的对照病毒则为3.5、1.5和0.5,为了进一步验证保护剂对FMDV抗原的保护性能,进行了FMDV146s抗原含量的测定。分别于4℃下保存150 d,37℃下保存40 h,测得结果分别为0.796、0.462μg/ml,而加保护剂A的对照病毒则为0.602、0.307μg/ml。[结论]该复合配方保护剂I(4#)对FMDV有效抗原的保护作用优于保护剂A,尤其是病毒保护剂对提高FMDV的冷冻保存时间和耐热效能作用明显。     

O型口蹄疫抗体金标检测试纸条判定标准的确立

本试验旨在迅速、准确检测口蹄疫阴性血清和阳性血清,确立O型口蹄疫抗体金标检测试纸条的判定标准。通过3批次O型口蹄疫抗体金标检测试纸条,对180份猪、牛、羊口蹄疫阴性血清,197份猪、牛O型口蹄疫弱阳性血清,317份猪、牛、羊O型口蹄疫阳性血清,223份牛Asia 1、A型口蹄疫阳性血清,600份田间血清样品进行检测,同时用O型口蹄疫液相阻断ELISA和O型口蹄疫正向间接血凝2种方法检测相同的血清样品。对3种方法检测的结果进行分析,并且将试纸条的检测线和质控线的显色情况与O型口蹄疫液相阻断ELISA的抗体滴度相比较。确立了试纸条的诊断标准:试纸条抗体滴度1∶2-为口蹄疫抗体阴性;试纸条抗体滴度1∶8+为O型口蹄疫阳性血清。根据试纸条的显色结果与液相阻断ELISA的结果的关系,绘制了比色卡。试纸条的判定标准检测血清结果与液相阻断ELISA和正向间接血凝结果分别进行统计学分析,试纸条与液相阻断ELISA和正向间接血凝相关性分别为y=1.142x+0.7421,y=1.1845x+0.8623;相关系数(r)分别为0.9221和0.9033。结果显示,O型口蹄疫抗体金标检测试纸条的判定标准的确立和比色卡的绘制,实现半定量分析,更加迅速、准确,适于实验室、基层兽医站和养殖场使用。     

应用BALB／c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB／c小鼠，同时设空白对照组，每组8只。免疫后每7d采血一次，用液相阻断ELISA（LPB-ELISA）检测血清抗体水平；第28d用800LD50同源强毒攻击，攻毒后36h，每组随机选取3只BALB／c小鼠，采全血，分别用每只BALg／c小鼠全血注射12只乳鼠，每组共注射36只乳鼠，以乳鼠试验判定BALB／c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明，免疫组BALB／c小鼠均可产生特异性抗体，保护率分别为75．0％、63．9％、36．1％；对照组小鼠血清抗体为阴性。提示，BALB／c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。     

猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

为建立一种检测口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）特异性IgA抗体的检测方法,本研究以原核表达系统表达纯化的FMDV结构蛋白VP1作为包被抗原,以鼠抗猪IgA单克隆抗体为二抗,辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体为三抗,建立猪A型FMDV特异性IgA抗体间接ELISA检测方法。确定抗原包被浓度为3.50 μg/mL,二抗与三抗的最佳稀释度为1∶10 000,二抗和三抗作用时间均为30 min。所建立的方法与抗猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒等病原的特异性IgA抗体间无交叉反应,A型口蹄疫感染样品的阳性检出率在90%以上,批内和批间重复性试验的变异系数介于3.16%~9.76%。该方法为监测FMDV特异性IgA抗体水平变化规律及猪的黏膜免疫效果评价及口蹄疫的早期诊断提供了一种新方法。     

口蹄疫病毒Asia Ⅰ/HeB株不同宿主适应毒及其多克隆抗体的鉴定

口蹄疫病毒接种乳鼠、豚鼠及BHK-21细胞,获得相应的适应毒。以各组织液中的口蹄疫病毒RNA为模板,反转录并扩增VP1基因,PCR产物琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,测序。测序结果与核酸数据库中口蹄疫病毒VP1基因比对,并将各适应毒扩增的VP1基因序列相互比对。结果表明:此毒为口蹄疫病毒,各适应毒间序列同源性达98%。并用口蹄疫病毒抗原进行SDS-PAGE,分别与大肠杆菌表达的口蹄疫病毒HeB株P1蛋白制备的多克隆兔抗及健康对照血清进行Western blot,对多克隆兔抗进行鉴定,并用间接ELISA测定此多克隆兔抗的效价。确定此多抗能中和FMDV结构蛋白,抗体效价>1∶800。