口蹄疫A型病毒AF/72株特异性鉴定及其豚鼠标准血清的制备

用口蹄疫A型病毒AF/72株的细胞毒AF/72/MF6/BF12,经测定其TCID50为108.0/ml;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其他7株口蹄疫A型病毒株比对,同源性均大于85%;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng/ml,远大于22 ng/ml的国际标准.将此细胞毒与弗氏佐剂联合制成灭活疫苗免疫豚鼠后分离血清,经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经ELISA检测此血清的抗体滴度、原血清、强阳性血清和弱阳性血清的中和效价均远小于1 ∶ 45.参照标准的要求,确定强阳性血清为口蹄疫A型病毒株AF/72的参考血清.     

口蹄疫A型病毒AF/72株参考血清的研制

[目的]研制口蹄疫A型病毒AF/72株参考血清,筛选对实际防疫更具针对性的A型FMD标准血清,为研发安全高效优质的A型FMD疫苗提供实物支撑。[方法]用国家口蹄疫参考实验室提供的口蹄疫A型病毒AF/72株的第12代细胞毒AF/72/MF6-BF12,经测定并经Kaber法计算其TCID50为10-8.0/ml;经紫外分光光度法测定其146 S含量,均值为189.0 ng/ml,远大于22.0 ng/ml的国际标准。将此细胞毒与弗氏佐剂联合制成灭活疫苗免疫豚鼠后分离得到血清。[结果]经物理性状检验、无菌检验和外源病毒检验,纯净性符合兽用生物制品标准要求;参照国际标准血清的抗体效价测定方法ELISA和微量细胞中和试验检测了此血清的抗体滴度,原血清,强阳性血清和弱阳性血清的中和效价均远小于1∶45,符合标准的要求。[结论]对比国际口蹄疫参考血清的抗体滴度确定强阳性血清为口蹄疫A型病毒AF/72株的参考血清,为以后筛选抗原谱广的制苗毒株提供实物支撑。     

口蹄疫A型病毒AF/72株免疫原性分析

用口蹄疫A型病毒AF/72株,经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其他5株A型口蹄疫病毒株比对,同源性均大于90%。将此病毒灭活后与弗氏佐剂联合制成灭活疫苗免疫豚鼠后分离血清,经液相阻断ELISA和微量细胞中和试验检测此血清的抗体效价,其均值分别为2.093和1.227。用微量细胞中和试验分别测定了AF/72参考血清对5株A型口蹄疫病毒的中和抗体效价,各试验重复3次,其平均值为2.156。分别计算AF/72对5株不同病毒株的r值,结果为0.79~0.92,均值为0.85。按照OIE标准,AF/72具有较强的免疫原性,抗原谱广,可作为制造口蹄疫A型疫苗的备选毒株。     

口蹄疫病毒O、A、Asia I型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

[目的]建立一种从田问样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA).[方法]采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体.将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and Asia I/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带.经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒.[结果]本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50(1:128倍稀释乳鼠毒)的病毒量.同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性12炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、Asia I型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%.试剂盒在4℃下可保存6个月.[结论]本试验研发的12蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值.     

口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法（GICA）。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50（1﹕128倍稀释乳鼠毒）的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原（SVD）、水泡性口炎（VS）、水泡性疹（VES）等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45 %、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%。试剂盒在4℃下可保存6个月。【结论】本试验研发的口蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值。     

鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)纯化及其检验

在鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)分离鉴定试验确定为鸽副黏病毒Ⅰ型强毒株的基础上,对该病毒株进行了蚀斑纯化,获得了鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)纯化毒株,并对纯化株传代后进行无菌检验、血凝试验、血凝抑制试验和病毒含量测定。结果显示,该纯化毒株纯净、有血凝性和血凝抑制性,病毒含量为10~(8.5)ELD_(50)/0.1 mL,初步判定纯化的鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)可作为鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)免疫效力试验攻毒毒株。     

Identification of Different Hosts-adapted FMDV Asia Ⅰ/HeB Strain and Its Polvclonal Antibodv

口蹄疫病毒接种乳鼠、豚鼠及BHK-21细胞,获得相应的适应毒.以各组织液中的口蹄疫病毒RNA为模板,反转录并扩增VP1基因,PCR产物琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,测序.测序结果与核酸数据库中口蹄疫病毒VP1基因比对,并将各适应毒扩增的VP1基因序列相互比对.结果表明:此毒为口蹄疫病毒,各适应毒间序列同源性达98％.并用口蹄疫病毒抗原进行SDSPAGE,分别与大肠杆菌表达的口蹄疫病毒HeB株P1蛋白制备的多克隆兔抗及健康对照血清进行Western blot,对多克隆兔抗进行鉴定,并用间接ELISA测定此多克隆兔抗的效价.确定此多抗能中和FMDV结构蛋白,抗体效价＞1∶800.     

口蹄疫病毒Asia Ⅰ/HeB株不同宿主适应毒及其多克隆抗体的鉴定

口蹄疫病毒接种乳鼠、豚鼠及BHK-21细胞,获得相应的适应毒。以各组织液中的口蹄疫病毒RNA为模板,反转录并扩增VP1基因,PCR产物琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,测序。测序结果与核酸数据库中口蹄疫病毒VP1基因比对,并将各适应毒扩增的VP1基因序列相互比对。结果表明:此毒为口蹄疫病毒,各适应毒间序列同源性达98%。并用口蹄疫病毒抗原进行SDS-PAGE,分别与大肠杆菌表达的口蹄疫病毒HeB株P1蛋白制备的多克隆兔抗及健康对照血清进行Western blot,对多克隆兔抗进行鉴定,并用间接ELISA测定此多克隆兔抗的效价。确定此多抗能中和FMDV结构蛋白,抗体效价>1∶800。     

湖南省“兔瘟”之研究——ⅩⅩⅢ.乳鼠实验模型的建立和应用

通过Y8504“兔瘟”病毒株在乳鼠连续断代,建立了一株能适应于乳鼠中生长的病毒。此病毒株能规律地致死接种的乳鼠。用乳鼠适应毒株,在乳鼠成功地进行了“兔瘟”病毒对物理和化学因素作用抵抗力的检测以及血清中和试验。本研究中所得结果与成年兔中试验的结果几乎一致。因此,可能用乳鼠适应毒株和乳鼠代替兔适应毒株和成年兔子“兔瘟”病毒特性的研究。     

A型口蹄疫病毒A/HeN/1/2009株全基因组序列的测定及其基因特征分析

[目的]测定A型口蹄疫病毒A/HeN/1/2009株全基因组序列并分析其基因特征,为研究我国最近发生的A型口蹄疫病毒的致病性、流行规律以及筛选适用的疫情防控疫苗株奠定分子基础。[方法]应用RT-PCR方法,分段扩增、克隆A/HeN/1/2009株基因,并进行基因测序;借助DNAStar分子生物学软件,从分子流行病学角度分析A/HeN/1/2009株与参考毒株之间可能的遗传衍化关系。[结果]该毒株基因组全长8 171 nts[不包括poly(C)区段和poly(A)尾巴],其中5'-UTR和3'-UTR分别为1 080、92 nts,蛋白编码区为6 999 nts。分析A/HeN/1/2009株遗传衍化关系显示,该毒株划为东南亚拓扑型Laos03系的VN09亚系,同源性依次为87.3%～91.8%、93.7%～94.5%和96.9%～98.4%。[结论]VP1中A24V、N85R、S196T,3A中I61V、T128S、E147G和A134V在该毒群的进化过程中扮演重要角色;A/SH/1/2009株VP1 140-160基序为RSD。     

大鼠品系PGR-iCre构建

采用CRISPR/Cas9基因编辑技术首次制备用于子宫基因敲除的PGR-iCre大鼠。PGR-iCre大鼠与含有Flox报告基因Tdtomato大鼠(Tdtomatof/f)杂交得到PGRCre+/--Tdtomatof/+大鼠。利用real-time PCR、免疫组化、荧光检测等技术检测Tdtomato基因在PGRCre+/--Tdtomatof/+大鼠不同器官表达,间接检测PGR驱动的Cre重组酶组织特异性表达。结果表明,PGR驱动Cre重组酶在大鼠子宫、卵巢、输卵管、乳腺、下丘脑、垂体、脾脏、肾脏、肺等器官不同程度表达;未检测到Cre重组酶在心脏、肝脏、肌肉中表达。综上,PGR-iCre大鼠可作为子宫基因敲除工具鼠研究大鼠子宫表达基因的相关功能。     

IBV肾型毒株与呼吸型疫苗株鉴别方法的建立与应用

[目的]建立基于鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的反转录-复合PCR方法,为IBV流行毒株和呼吸型疫苗株的分型鉴定提供技术支持.[方法]根据IBV N基因序列设计合成1对特异性通用引物,建立IBV的分子生物学检测方法,用以对IBV进行检测.通过对GenBank上公布的IBV S1基因全序列的分析比对,找出呼吸型疫...     

纤维素酶产生菌的筛选

从自制腐烂稻草及附近土壤筛选分离到一株高纤维素酶活性的纤维素分解菌ZJ-8,经初步鉴定为根霉菌.经紫外诱变后,该菌羧甲基纤维素酶活性最高达11.07～14.5 IU/mL,对滤纸有较强的降解能力,并且具有稳定的遗传性.该菌最适生长条件温度为30 ℃,pH值为5.     

产纤维素酶菌株C真3的筛选

对19株产纤维素酶菌株进行摇床发酵试验，并对其产生的纤维素酶进行滤纸酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活测定，初步筛选出1株产纤维素酶活力较高的菌株C真3。     

产纤溶酶菌株的分离筛选

以脱脂奶粉作为初筛底物,纤维蛋白作为复筛底物,透明圈作为筛选标记,从肉联厂,污水沟等地筛选出产纤溶酶的菌株40株,从中筛选出产酶活力最高的2号菌株,将其编号为ZLW-2,并采用改进的紫外分光光度法测酶活,提高了酶活测定的精确性,对提高纤溶酶产生菌的筛选效率有重要意义。菌株ZLW-2的发酵过程研究表明,纤溶酶是在菌体大量生长以后酶活力才开始增加。     

酵母zjy2菌株培养条件研究及其制剂安全性评价

通过对酵母zjy2菌株进行培养条件研究,并对其制剂按照《食品安全性毒理学评价程序》进行安全性评价,结果表明,液体培养以麦芽汁为培养基、pH值6左右、转速200转/min较好,固体培养采用麸皮80% 菜饼20%混合发酵,1%的接种量,培养料的含水率控制在50%~60%为好,培养温度25~30℃较好。按霍恩氏法未能测得酵母制剂的LD50,测得其对小鼠经口给药最大耐受量大于40 g/kg(相当于1 kg猪每天摄入量的400倍),属实际无毒。     

基于菌株生长和菌根苗品质的红汁乳菇菌株筛选

【目的】筛选用于菌根苗接种的高质量红汁乳菇菌株，为提高红汁乳菇产量提供支持。【方法】以10个红汁乳菇菌株（JH1、JH2、JH4、JH5、JH7、JH8、JH10、JH11、JH12、JH13）为研究对象，将菌株分别在PDA和BAF培养基上培养后，测定菌株生长势指标（菌丝生长速度、菌丝生物量）；将红汁乳菇液体菌种接种于马尾松幼苗根部合成菌根苗，以不接种为对照（CK），培养210 d后对菌根合成能力（菌根数量、菌根侵染率、菌根化率）和宿主植物生长量（苗高、主根长、地径、干质量）进行测定。对上述9个参数进行相关性分析，并用隶属函数法对菌株性状进行综合评价。【结果】①在PDA固体培养基上，以菌株JH1菌丝生长速度最快，达到3.17 mm/d；在BAF液体培养基上，以菌株JH5的菌丝生物量最大，为3.28 g/L。②所有菌株均能与马尾松根系形成外生菌根，但菌根形态并不相同。接种红汁乳菇菌株JH5的马尾松苗的菌根数量为45.65个/株，菌根化率为90.67%，菌根侵染率为79.60%，显著高于其他9个菌株，表现出较强的合成菌根苗能力。③接种不同红汁乳菇菌株的马尾松苗，在苗高、主根长、地径和干质量等指标上表现各异。接种菌株JH4的马尾松苗高、主根长和干质量表现最优，较对照分别提高24.45%，16.72%和53.33%；接种菌株JH5的马尾松苗地径生长量表现最优，较对照提高5.19%。④相关性分析表明，菌丝生物量与菌根化率和菌根苗干质量呈极显著正相关（P＜0.01），菌根数量与菌根化率和菌根苗地径呈极显著正相关（P＜0.01）。⑤基于隶属函数法的综合评价结果表明，红汁乳菇JH5为适合培育菌根苗的最佳菌株，JH4和JH7为次优菌株。【结论】筛选出1个优良红汁乳菇菌株JH5，该菌株的生长势和菌根苗品质整体表现较好。     

沙门菌标准株及其环丙沙星耐药株蛋白表达差异分析

【目的】比较鼠伤寒沙门菌标准株及其环丙沙星体外诱导耐药株菌的蛋白表达图谱差异,分析这些蛋白在鼠伤寒沙门菌诱导耐药过程中的作用,为沙门菌耐药机理的研究提供参考。【方法】将沙门菌标准株和环丙沙星耐药株在LB培养基中培养至对数期,然后超声破碎细菌制备蛋白样品,进行二维电泳,电泳胶经扫描分析后选取差异表达蛋白点进行质谱鉴定。【结果】沙门菌环丙沙星耐药株与标准株有25个差异表达蛋白,其中磷酸化孔蛋白PhoE、二氢硫辛酰胺脱氢酶组件蛋白、ATP合成酶、细胞侵袭蛋白SipD的A亚基、锰过氧化氢酶、二氢硫辛酰胺转琥珀酰酶、果糖二磷酸醛缩酶、假定蛋白AF355_20900等8个蛋白表达量下调,磷酸乙酰基转移酶、天冬氨酸转氨酶、RND家族外排泵的膜融合蛋白、鞭毛马达开关FliM、三磷酸甘油醛脱氢酶、OmpA外膜蛋白、蛋白质链伸长因子EF-Ts、丙二醇利用蛋白PduB、NAD(P)H硝基还原酶、假定硫醇-烷基过氧化氢还原酶、50S核糖体亚基L4、肽ABC转运体结合蛋白、假定的胞质蛋白、锰超氧化物歧化酶、30S核糖体S4亚基、TolC外膜蛋白、短链脱氢酶等17个蛋白表达量上调。这25个差异蛋白中,有1个(1号)与抗药性无关,有2个(8和21号)为未知功能蛋白,其余22个是与细菌耐药性相关的蛋白。这22个蛋白可分为4类,其中耐药相关蛋白5个、毒力相关蛋白2个、蛋白质合成相关蛋白3个、代谢相关蛋白12个;其亚细胞定位为:细胞质中的蛋白15个、外膜蛋白3个、细胞质内膜蛋白2个、周质蛋白和细胞外蛋白各1个。【结论】与沙门菌标准株相比,耐环丙沙星沙门菌有25个差异表达蛋白(8个表达下调,17个表达上调),其中22个与耐药性相关,分属4个功能类别,定位于5个亚细胞组分。