甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为口蹄疫病毒核酸疫苗递送载体的特性评价

旨在对制备的甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly （D，L-lactide-co-glycolide），PLGA]纳米微球作为口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）核酸疫苗递送载体进行评价。采用西佛碱反应和元素分析制备具有一定取代度的甘露糖修饰的壳聚糖衍生物（mannose modified chitosan，MCS），然后，经双重乳化挥发法制备得到甘露糖修饰的壳聚糖PLGA纳米微球（MCS-PLGA-NPs）。采用纳米粒径仪检测MCS-PLGA-NPs粒径分布和表面电势（zeta）、扫描电镜考察其形态、琼脂糖凝胶电泳观察其对质粒的吸附和吸附质粒后抵抗核酸酶降解能力、CCK-8法检测MCS-PLGA-NPs的细胞毒性、激光共聚焦观察巨噬细胞对MCS-PLGA-NPs-质粒DNA复合物的摄取、荧光显微镜和Western blot验证MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA在细胞中的表达。元素分析结果表明，成功制备了取代度为5%~10%的MCS。纳米粒径测定和扫描电镜结果表明，MCS-PLGA-NPs的zeta为正值、粒径分布均匀且形态规则呈球形。琼脂糖凝胶电泳结果显示，MCS-PLGA-NPs吸附质粒的能力随着其质量的增加而增强并且可以在一定程度上抵抗核酸酶降解质粒DNA。在细胞毒性试验中，不同浓度的MCS-PLGA-NPs与RAW264.7细胞共孵育24 h后，细胞存活率仍在85%以上。在细胞摄取试验中，用激光共聚焦显微镜可以明显观察到质粒DNA结合到纳米微球表面被RAW264.7细胞摄取。荧光显微镜和Western blot试验证明MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA可以在细胞中进行表达。综上表明，本研究成功制备了MCS以及具有递送核酸疫苗能力的MCS-PLGA-NPs，为FMDV核酸疫苗的递送研究提供了新的方向和见解，也为该递送载体携带特定抗原靶向抗原递呈细胞表面甘露糖受体以及应用于动物免疫的研究奠定基础。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1上B细胞表位的筛选鉴定

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72 VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据.     

口蹄疫病毒抗原保护剂的筛选和优化

用三因素、三水平、双重复正交试验筛选出对口蹄疫病毒(FMDV)抗原保护效果较好的4号保护剂配方,该保护剂保存的病毒在37 ℃静置40 h和50 h后毒价TCID50分别为4.5和2.0,而对照组病毒则分别降至1.5和0.通过方差分析4号保护剂保存病毒测得TCID50极显著的高于1、3、5、6、7、8号,显著高于2、9号.保护剂配方优化试验结果表明,加该保护剂的病毒,分别于-20 ℃和4 ℃下保存90 d、120 d、150 d,其㏒TCID50分别为6.0、6.0、5.8和5.3、5.0、4.5,而未加保护剂的对照病毒则为5.8、5.3、5.0和5.0、4.5、4.3;FMDV 146 s抗原含量测定结果表明,分别于-20 ℃和4 ℃下保存150 d,37 ℃下保存40 h,测得结果分别为1.116 μg·mL-1、0.896 μg·mL-1、0.888 μg·mL-1,而未加保护剂的对照病毒则为0.846 μg·mL-1、0.802 μg·mL-1、0.307 μg·mL-1;反复冻融试验表明对照组冻融6次即为临界点, 病毒保护剂组达10次;通过对主要保护性抗原VP1基因,试验病毒株(O/NX/99/1)、对照病毒株(O/NX/99/2)测序比对,结果表明保护剂不会使病毒产生基因突变.试验结果说明该保护剂对FMDV有效抗原确实有较好的保护作用.     

口蹄疫A型病毒AF/72株标准乳鼠组织毒的研制

用口蹄疫A型病毒AF/72株的第3代乳鼠组织毒,通过乳鼠适应至6代,获得该毒株的乳鼠组织毒AF/72/MF6,经测定其LD50为10^-8.0·mL^-1;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其它6株口蹄疫A型病毒株比对,同源性大于85%;经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且经乳鼠中和试验证实该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng·mL^-1,远大于22 ng·mL^-1的国际标准。综合纯净性检验、特异性检验和146S含量测定结果,可确定AF/72/MF6为口蹄疫A型病毒AF/72株乳鼠组织毒的标准毒。     

基于主成分分析的襄阳市水资源短缺风险评价

为了评价水资源短缺风险系数,在探讨风险评价理论方法的基础上,构建了水资源风险短缺评价指标体系,采用主成分分析法,从时间和空间两个方面较系统地分析评价了襄阳市水资源短缺的原因、影响因素及变动趋势。结果表明：襄阳市水资源短缺现象日益严峻,8 个行政分区中襄阳市城区、襄州区、枣阳市、宜城市、老河口市等5 个出现水资源严重短缺状况,这一结论与多指标综合评价结果具有较好的一致性,经验证方法可行、结论可靠。     

南水北调中线工程与区域经济可持续发展

介绍了南水北调中线工程、受水区经济发展现状及水资源短缺对经济发展的影响等问题。提出在实施南水北调中线工程的同时应树立节水观念,建设节水型社会,发展节水型产业,加大治理污染力度,解决好水库移民安置问题,进行受水区域的生态修复规划,建立新的水资源管理体制以及合理的水价形成机制等建议。     

猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

为建立一种检测口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）特异性IgA抗体的检测方法,本研究以原核表达系统表达纯化的FMDV结构蛋白VP1作为包被抗原,以鼠抗猪IgA单克隆抗体为二抗,辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体为三抗,建立猪A型FMDV特异性IgA抗体间接ELISA检测方法。确定抗原包被浓度为3.50 μg/mL,二抗与三抗的最佳稀释度为1∶10 000,二抗和三抗作用时间均为30 min。所建立的方法与抗猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒等病原的特异性IgA抗体间无交叉反应,A型口蹄疫感染样品的阳性检出率在90%以上,批内和批间重复性试验的变异系数介于3.16%~9.76%。该方法为监测FMDV特异性IgA抗体水平变化规律及猪的黏膜免疫效果评价及口蹄疫的早期诊断提供了一种新方法。     

口蹄疫病毒Asia Ⅰ/HeB株不同宿主适应毒及其多克隆抗体的鉴定

口蹄疫病毒接种乳鼠、豚鼠及BHK-21细胞,获得相应的适应毒。以各组织液中的口蹄疫病毒RNA为模板,反转录并扩增VP1基因,PCR产物琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,测序。测序结果与核酸数据库中口蹄疫病毒VP1基因比对,并将各适应毒扩增的VP1基因序列相互比对。结果表明:此毒为口蹄疫病毒,各适应毒间序列同源性达98%。并用口蹄疫病毒抗原进行SDS-PAGE,分别与大肠杆菌表达的口蹄疫病毒HeB株P1蛋白制备的多克隆兔抗及健康对照血清进行Western blot,对多克隆兔抗进行鉴定,并用间接ELISA测定此多克隆兔抗的效价。确定此多抗能中和FMDV结构蛋白,抗体效价>1∶800。     

缺水城市的人口和用地规模定量评价

根据城市可持续发展和经济、环境、社会综合效益最大化原则,提出了可大致刻画城市人口和用地规模与经济、环境、社会相互关系的数学模型,并找到了一个评价当前缺水城市人口和用地规模是否满足经济、环境、社会均具有较强可持续发展性要求的指标。     

汉江水文化旅游资源及其开发的SWOT分析

通过挖掘汉江水文化旅游资源,进行水文化旅游资源开发的SWOT分析,为汉江水文化旅游资源的开发提供理论依据。