甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为口蹄疫病毒核酸疫苗递送载体的特性评价

旨在对制备的甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly （D，L-lactide-co-glycolide），PLGA]纳米微球作为口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）核酸疫苗递送载体进行评价。采用西佛碱反应和元素分析制备具有一定取代度的甘露糖修饰的壳聚糖衍生物（mannose modified chitosan，MCS），然后，经双重乳化挥发法制备得到甘露糖修饰的壳聚糖PLGA纳米微球（MCS-PLGA-NPs）。采用纳米粒径仪检测MCS-PLGA-NPs粒径分布和表面电势（zeta）、扫描电镜考察其形态、琼脂糖凝胶电泳观察其对质粒的吸附和吸附质粒后抵抗核酸酶降解能力、CCK-8法检测MCS-PLGA-NPs的细胞毒性、激光共聚焦观察巨噬细胞对MCS-PLGA-NPs-质粒DNA复合物的摄取、荧光显微镜和Western blot验证MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA在细胞中的表达。元素分析结果表明，成功制备了取代度为5%~10%的MCS。纳米粒径测定和扫描电镜结果表明，MCS-PLGA-NPs的zeta为正值、粒径分布均匀且形态规则呈球形。琼脂糖凝胶电泳结果显示，MCS-PLGA-NPs吸附质粒的能力随着其质量的增加而增强并且可以在一定程度上抵抗核酸酶降解质粒DNA。在细胞毒性试验中，不同浓度的MCS-PLGA-NPs与RAW264.7细胞共孵育24 h后，细胞存活率仍在85%以上。在细胞摄取试验中，用激光共聚焦显微镜可以明显观察到质粒DNA结合到纳米微球表面被RAW264.7细胞摄取。荧光显微镜和Western blot试验证明MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA可以在细胞中进行表达。综上表明，本研究成功制备了MCS以及具有递送核酸疫苗能力的MCS-PLGA-NPs，为FMDV核酸疫苗的递送研究提供了新的方向和见解，也为该递送载体携带特定抗原靶向抗原递呈细胞表面甘露糖受体以及应用于动物免疫的研究奠定基础。     

小RNA病毒基因组3'非编码区.结构与功能研究进展

小RNA病毒属于单股正链RNA病毒,包括肠道病毒属、鼻病毒属、心脏病毒属、口疮病毒属和肝病毒属等几个主要的属.口蹄疫病毒(FMDV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、丙型肝炎病毒(HCV)、脑心肌炎病毒(EMCV)是该科病毒的典型代表.小RNA基因组的末端具有非编码区(UTR),是病毒基因组复制的主要调控位点,3'非编码(3'...     

金露梅黄酮提取工艺的响应面优化及其抗氧化和降血糖活性分析

【目的】优化金露梅中黄酮的超声提取工艺条件,检测黄酮化合物的种类及含量,并分析其抗氧化和降血糖活性,为金露梅的综合利用提供技术支持。【方法】以总黄酮提取率为指标,采用单因素和响应面分析法对超声提取金露梅黄酮的主要工艺参数进行优化分析,利用多重层析柱对黄酮化合物进行分离纯化,并比较各组分的抗氧化和降血糖活性。【结果】 4个因素对金露梅总黄酮提取率影响的显著性顺序为液料比>超声时间>乙醇体积分数>超声功率,建立的回归方程为Y=37.84+14.48A+14.93B+3.02C+9.38D-0.03AB-0.66AC-0.01AD-0.01BD-0.01CD-14.71A2-11.25B2-16.96C2-12.89D2（Y表示总黄酮提取率,A、B、C、D分别表示液料比、乙醇体积分数、超声功率和超声时间）;超声提取金露梅黄酮的最佳工艺条件为:液料比39.78:1 （mL/g）、乙醇体积分数65.47%、超声功率390.98 W、超声时间49.55 min,在此条件下金露梅总黄酮提取率为47.59 mg/g。金露梅黄酮化合物中发现含有8种化合物,其中含量最高的为槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸（10.90 mg/g）。柚皮素对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率最低,仅为5.0%,其余7种化合物对DPPH自由基的清除率均达50.0%以上,表现出良好的抗氧化活性。金露梅黄酮化合物对葡萄糖消耗率均高于二甲基亚砜（DMSO）,其中（+）-儿茶素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸和3-阿拉伯葡萄糖基槲皮素对葡萄糖的消耗率达19.5%以上,表现出良好的降血糖活性。【结论】经响应面优化的金露梅黄酮超声提取工艺切实可行,建立的回归方程具有较高的准确性;多重层析柱法可实现金露梅中黄酮化合物的分离纯化,各组分除柚皮素外,均具有明显的抗氧化活性,且各组分化合物均有一定的降血糖活性。金露梅可作为一种天然抗氧化剂和降血糖剂来源在食品、医药等方面进行开发利用。     

大黄化学成分与药理作用研究进展

大黄是一种常用的中国传统中药,其味苦,性寒,归脾、胃、大肠、肝、心包经。大黄的主要化学成分为蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、鞣质、有机酸及多糖类等。经药理学研究证实,大黄的药理作用包括泻下、抗菌、抗炎、抗肿瘤、改善肾功能、利胆、保肝、利尿、抗凝血、促智、抗衰老、清除氧自由基、免疫调节、毒性等多种作用,本文旨在分析大黄化学成分与药理作用的研究进展。     

应用BALB／c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB／c小鼠，同时设空白对照组，每组8只。免疫后每7d采血一次，用液相阻断ELISA（LPB-ELISA）检测血清抗体水平；第28d用800LD50同源强毒攻击，攻毒后36h，每组随机选取3只BALB／c小鼠，采全血，分别用每只BALg／c小鼠全血注射12只乳鼠，每组共注射36只乳鼠，以乳鼠试验判定BALB／c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明，免疫组BALB／c小鼠均可产生特异性抗体，保护率分别为75．0％、63．9％、36．1％；对照组小鼠血清抗体为阴性。提示，BALB／c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。     

O型口蹄疫抗体金标检测试纸条判定标准的确立

本试验旨在迅速、准确检测口蹄疫阴性血清和阳性血清,确立O型口蹄疫抗体金标检测试纸条的判定标准。通过3批次O型口蹄疫抗体金标检测试纸条,对180份猪、牛、羊口蹄疫阴性血清,197份猪、牛O型口蹄疫弱阳性血清,317份猪、牛、羊O型口蹄疫阳性血清,223份牛Asia 1、A型口蹄疫阳性血清,600份田间血清样品进行检测,同时用O型口蹄疫液相阻断ELISA和O型口蹄疫正向间接血凝2种方法检测相同的血清样品。对3种方法检测的结果进行分析,并且将试纸条的检测线和质控线的显色情况与O型口蹄疫液相阻断ELISA的抗体滴度相比较。确立了试纸条的诊断标准:试纸条抗体滴度1∶2-为口蹄疫抗体阴性;试纸条抗体滴度1∶8+为O型口蹄疫阳性血清。根据试纸条的显色结果与液相阻断ELISA的结果的关系,绘制了比色卡。试纸条的判定标准检测血清结果与液相阻断ELISA和正向间接血凝结果分别进行统计学分析,试纸条与液相阻断ELISA和正向间接血凝相关性分别为y=1.142x+0.7421,y=1.1845x+0.8623;相关系数(r)分别为0.9221和0.9033。结果显示,O型口蹄疫抗体金标检测试纸条的判定标准的确立和比色卡的绘制,实现半定量分析,更加迅速、准确,适于实验室、基层兽医站和养殖场使用。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1上B细胞表位的筛选鉴定

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72 VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据.     

口蹄疫A型病毒AF/72株标准乳鼠组织毒的研制

用口蹄疫A型病毒AF/72株的第3代乳鼠组织毒,通过乳鼠适应至6代,获得该毒株的乳鼠组织毒AF/72/MF6,经测定其LD50为10^-8.0·mL^-1;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其它6株口蹄疫A型病毒株比对,同源性大于85%;经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且经乳鼠中和试验证实该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng·mL^-1,远大于22 ng·mL^-1的国际标准。综合纯净性检验、特异性检验和146S含量测定结果,可确定AF/72/MF6为口蹄疫A型病毒AF/72株乳鼠组织毒的标准毒。     

口蹄疫病毒抗原保护剂的筛选和优化

用三因素、三水平、双重复正交试验筛选出对口蹄疫病毒(FMDV)抗原保护效果较好的4号保护剂配方,该保护剂保存的病毒在37 ℃静置40 h和50 h后毒价TCID50分别为4.5和2.0,而对照组病毒则分别降至1.5和0.通过方差分析4号保护剂保存病毒测得TCID50极显著的高于1、3、5、6、7、8号,显著高于2、9号.保护剂配方优化试验结果表明,加该保护剂的病毒,分别于-20 ℃和4 ℃下保存90 d、120 d、150 d,其㏒TCID50分别为6.0、6.0、5.8和5.3、5.0、4.5,而未加保护剂的对照病毒则为5.8、5.3、5.0和5.0、4.5、4.3;FMDV 146 s抗原含量测定结果表明,分别于-20 ℃和4 ℃下保存150 d,37 ℃下保存40 h,测得结果分别为1.116 μg·mL-1、0.896 μg·mL-1、0.888 μg·mL-1,而未加保护剂的对照病毒则为0.846 μg·mL-1、0.802 μg·mL-1、0.307 μg·mL-1;反复冻融试验表明对照组冻融6次即为临界点, 病毒保护剂组达10次;通过对主要保护性抗原VP1基因,试验病毒株(O/NX/99/1)、对照病毒株(O/NX/99/2)测序比对,结果表明保护剂不会使病毒产生基因突变.试验结果说明该保护剂对FMDV有效抗原确实有较好的保护作用.