蓝舌病病毒血清Ⅰ型VP2与VP5、VP3与VP7两组蛋白在杆状病毒系统中的表达与鉴定

为表达具有天然构象的蓝舌病病毒血清1型(BTV1)主要结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7,研制针对流行于我国的BTV1型毒株的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)疫苗提供基础,将编码BTV1 VP2和VP5蛋白的基因分别克隆到双表达载体pFastBacDual的启动子pPH和pP10下游,构建重组质粒pFastBacDualBTV1-VP2-VP5,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒rBacmidBTV1-VP2-VP5,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacBTV1-VP2-VP5;按照同样策略,制备重组杆状病毒rBacBTV1-VP3-VP7。使用兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗体和鼠抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行间接免疫荧光试验(IFA)检测,结果病毒感染细胞可见特异性荧光出现;使用兔抗BTV1-VP2蛋白多克隆抗体和兔抗BTV1-VP3蛋白多克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和r BacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行Western-blot检测,可见相对分子质量约100 kDa左右的条带,大小与预期相符。IFA检测和Western Blot检测结果显示,BTV1 VP2、VP3、VP5和VP7蛋白均得以表达,且具有良好的反应原性。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及其在重组杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒VP1基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了VP1基因片段．将pMD18-VP1质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用BamHⅠ及Hind Ⅲ酶切后，用T4 DNA连接酶连接。构建了重组质粒pFastBac-VP1；再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌。在菌体内进行重组，并经三重抗性与蓝白斑筛选。得到杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1；将Bacmid-VP1转染Sf9细胞．获得重组杆状病毒．并进行表达水平的检测。经SDS-PAGE和Western-blotting检测。结果表明，VP1蛋白在重组杆状病毒中获得表达。     

A型塞内卡病毒VP1结构蛋白在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定

目前在昆虫杆状病毒表达系统（baculovirus expression vector system,BEVS）中表达A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）结构蛋白VP1尚未见报道。本研究将VP1基因通过限制性酶切位点插入杆状病毒载体pFastBac I,然后将鉴定正确的重组载体转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,对鉴定正确的菌落提取质粒。将质粒转染Sf9昆虫细胞,待有明显细胞病变后收获重组杆状病毒rBac-I-VP1,并进行病毒滴度测定。随后通过蛋白免疫印记（Western Blot）和间接免疫荧光（IFA）鉴定VP1蛋白表达情况。结果显示,重组杆状病毒rBac-I-VP1滴度为6.8×105 pfu/mL;Western Blot可检测到相对分子质量约27 kDa的表达产物,且其能够被SVA兔阳性多克隆血清识别;IFA试验显示,VP1蛋白能够在Sf9细胞内表达。结果表明,本研究利用BEVS表达的SVA VP1蛋白具有良好的免疫反应性,为其后期功能研究及SVA诊断试剂研制提供了技术基础。     

BTV-16四结构蛋白的共表达与病毒样颗粒的制备

目前疫苗免疫是预防蓝舌病的主要有效手段,蓝舌病病毒样颗粒(VLPs)疫苗是蓝舌病疫苗研究的热点之一。为了制备蓝舌病病毒血清16型(BTV-16)病毒样颗粒,研究对载体pFastBac-Dual进行了改造,使其具有4个独立启动子的多克隆位点。依次将BTV-16 VP2、VP5、VP3和VP7基因插入到改造后载体(pF4)的4个多克隆位点中,成功构建了四表达重组质粒pF4-VP2-VP5-VP3-VP7,经转座获得重组杆粒Bacmid-VP2-VP5-VP3-VP7。通过转染Sf9细胞,获得可表达4种蛋白的重组杆状病毒rBac-VP2-VP5-VP3-VP7。经重组杆状病毒感染Sf9细胞,可共表达蛋白VP2、VP5、VP3和VP7,并通过蔗糖梯度离心制备出具有典型特征的BTV-16病毒样颗粒。     

蓝舌病病毒衣壳蛋白VP2、VP5、VP7酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定

蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的结构主要由3层衣壳蛋白组成,其中VP2、VP5蛋白构成了BTV的外层衣壳,VP7蛋白构成了BTV的中间衣壳,最内层衣壳则由VP3蛋白构成。VP2、VP5及VP7蛋白在BTV侵染宿主细胞的过程中起着非常重要的作用。为了研究BTV与宿主细胞相互作用的分子机制,本研究将BTV的VP 2、VP 5、VP 7基因分别克隆到pGBKT7载体中,成功构建了pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP5与pGBKT7-VP73个诱饵质粒,且通过自激活和毒性验证,证明所构建的3个质粒均无自激活作用,对酵母细胞无毒性作用。本研究为今后利用酵母双杂交筛选VP2、VP5、VP7蛋白中与宿主细胞相互作用的蛋白做好了铺垫,为深入研究BTV与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

猪O型口蹄疫病毒样颗粒的构建及鉴定

为开发猪O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLPs)基因工程亚单位疫苗,试验参考GenBank中登录的FMDV毒株基因序列(登录号:JN998085),设计针对VP1、VP2、VP3和VP4 4个基因片段的特异性引物,以O型FMDV O/MYA98/XJ/2010毒株的cDNA序列为模板,对目的基因进行PCR扩增;将获得的VP3、VP1和VP4、VP2基因片段分别插入2个杆状病毒供体质粒(pFastBacDual)的p10和pH双元启动子中,构建pFBD-VP3-VP1和pFBD-VP4-VP2 2个重组转座质粒;将验证正确的2个重组转座质粒分别转化含有穿梭载体(Bacmid)的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得2个重组杆粒rBacmid-VP3-VP1和rBacmid-VP4-VP2,经验证正确后,对其进行扩增和提取,将其分别转染Sf9贴壁昆虫细胞,构建2个重组杆状病毒rvAc-VP3-VP1和rvAc-VP4-VP2;2个重组杆状病毒共同感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内对4个基因进行表达,目的蛋白通过间接免疫荧光试验(IFA)、SDS-PAGE、Western blotting及透射电镜(EM)进行检测。结果显示,本研究成功构建2株分别表达FMDV VP1、VP2、VP3和VP4 4个结构蛋白的重组杆状病毒;特异性抗体检测发现,4个蛋白VP1～VP4均成功表达,且具有良好的特异性反应;4个蛋白在Sf9昆虫细胞内能够完成自我组装,形成与天然病毒结构相似的VLPs,直径大小在25～30 nm。本研究利用共感染表达方式在Sf9昆虫细胞内成功制备出FMDV病毒颗粒,为开发高效安全的FMDV基因工程亚单位疫苗开辟了一条新思路。     

1型鸭肝炎病毒E53株VP1基因在昆虫细胞中的表达及产物分析

根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。     

猪O型口蹄疫病毒样颗粒的构建及鉴定

为开发猪O型口蹄疫病毒（FMDV）病毒样颗粒（VLPs）基因工程亚单位疫苗,试验参考GenBank中登录的FMDV毒株基因序列（登录号：JN998085）,设计针对VP1、VP2、VP3和VP4 4个基因片段的特异性引物,以O型FMDV O/MYA98/XJ/2010毒株的cDNA序列为模板,对目的基因进行PCR扩增;将获得的VP3、VP1和VP4、VP2基因片段分别插入2个杆状病毒供体质粒（pFastBacDual）的p10和pH双元启动子中,构建pFBD-VP3-VP1和pFBD-VP4-VP2 2个重组转座质粒;将验证正确的2个重组转座质粒分别转化含有穿梭载体（Bacmid）的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得2个重组杆粒rBacmid-VP3-VP1和rBacmid-VP4-VP2,经验证正确后,对其进行扩增和提取,将其分别转染Sf9贴壁昆虫细胞,构建2个重组杆状病毒rvAc-VP3-VP1和rvAc-VP4-VP2;2个重组杆状病毒共同感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内对4个基因进行表达,目的蛋白通过间接免疫荧光试验（IFA）、SDS-PAGE、Western blotting及透射电镜（EM）进行检测。结果显示,本研究成功构建2株分别表达FMDV VP1、VP2、VP3和VP4 4个结构蛋白的重组杆状病毒;特异性抗体检测发现,4个蛋白VP1~VP4均成功表达,且具有良好的特异性反应;4个蛋白在Sf9昆虫细胞内能够完成自我组装,形成与天然病毒结构相似的VLPs,直径大小在25~30 nm。本研究利用共感染表达方式在Sf9昆虫细胞内成功制备出FMDV病毒颗粒,为开发高效安全的FMDV基因工程亚单位疫苗开辟了一条新思路。     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因的表达及免疫原性研究

为探索鸡传染性贫血重组蛋白亚单位疫苗的可行性,将鸡传染性贫血病毒基因分别克隆到转移载体p Fast Bac HTA中,再将其分别转化DH10Bac感受态细胞得到相应的重组表达载体,转染昆虫细胞Sf21获得含有VP1、VP2基因的重组杆状病毒v Bac-VP1、v Bac-VP2,应用悬浮培养的Sf21细胞表达重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting结果证明,VP1、VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,动物试验进一步证实,重组蛋白免疫SPF鸡可产生ELISA抗体,提示杆状病毒表达的VP1、VP2具有良好的免疫原性。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP 1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。     

兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果

用RT—PCR方法扩增兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白VP60基因,通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid—VP60,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV—Bac—VP60,经RT—PCR、IFA、SDS-PAGE、Western blotting、HA和HI鉴定,结果显示重组VP60蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达。在不加任何佐剂的情况下,用表达的蛋白免疫3月龄非RHD免疫兔,结果显示,免疫后21天,兔体内可产生抗RHDV抗体,抗体血凝抑制效价为2^6～2^7,该抗体可以抵抗血凝效价为2^10致死剂量RHDV强毒的攻击,本研究为兔病毒性出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对Asia Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VPl基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白功能及建立Asia Ⅰ型FMDV血清学诊断方法奠定基础.采用PCR方法从pGEM-T-Easy-Asia Ⅰ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BaeHTA-VPl再转入DH10Bae感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Baemid-VPl,然后转染Sf9昆虫细胞.PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Baemid-VP1,SDS-PAGE和West-ern-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白.将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出Asia Ⅰ型口蹄疫病毒阳性血清.Asia Ⅰ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础.     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

本研究将鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)JM-1/10株VP2基因克隆至pcDNA-3.1(+)启动子CMV之后,随后将CMV-VP2基因序列一同克隆入杆状病毒表达系统的质粒 pFastBac^TM Daul中构建了pFast-CMV-VP2。将pFast-CMV-VP2转化Escherichia coli DH10Bac感受态细胞,筛选出重组质粒Bacmid-CMV-VP2。用 Bacmid-CMV-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒vBac-CMV-VP2。将该重组杆状病毒转导BHK-21细胞,48~72 h后经间接免疫荧光试验(IFA)检测到VP2蛋白具有特异性荧光;样品经Western blotting分析,结果显示目的蛋白得到表达。结果表明,本试验制备的重组 vBac-CMV-VP2 既能在昆虫细胞中表达,也可在哺乳动物细胞中表达。     

VP22融合猪细小病毒VP2蛋白在杆状病毒系统中的表达及免疫原性分析

旨在利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达融合VP22短肽的重组猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白VP2,分析其免疫原性。以PPV N株为模板,通过重叠延伸PCR技术分别将VP22融合到VP2基因的N端或C端,构建重组杆状病毒rBV-VP2、rBV-VP22-VP2和rBV-VP2-VP22,通过感染昆虫细胞进行重组蛋白的表达,并在小鼠上初步验证其免疫原性。间接免疫荧光和Western blot分析结果表明表达产物均能与鼠抗PPV抗体发生特异性反应;透射电镜观察到rBV-VP2、rBV-VP22-VP2的表达产物可装配形成直径约22～24 nm的病毒样粒子,VP2-VP22没有观察到病毒样粒子。PPV ELISA抗体检测结果显示,3种表达产物均能有效诱导小鼠产生PPV特异性抗体,其中VP2、VP22-VP2组产生抗体水平与PPV灭活苗相当;细胞因子检测结果显示,3种表达产物均能有效刺激细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,其中VP22-VP2组IL-2和IFN-γ的含量要显著高于VP2和PPV灭活苗组及重组蛋白VP2-VP22组,表明VP2 N端融合VP22蛋白的免疫效果要优于其C端,VP22-VP2虽不能提高VP22蛋白的体液免疫效果,但具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力。     

VP22短肽融合猪圆环病毒2型重组病毒样颗粒的构建及其鉴定

采用融合PCR方法将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因和人单纯疱疹病毒Ⅰ型病毒(HSV-1)VP22蛋白转导域串联得到Cap-VP22基因,将其插入到杆状病毒转移载体pFastBac Dual构建pFast-Cap-VP22重组转移载体,通过转化含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含Cap-VP22基因的重组穿梭质粒rBac-2Cap-VP22。重组穿梭质粒转染昆虫细胞(Sf9),获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)、电镜观察对表达产物进行检测。结果表明,成功构建含双拷贝Cap-VP22基因的杆状病毒载体,IFA证实重组蛋白在Sf9细胞中获得正确表达,与PCV2阳性血清具有良好的反应原性;电镜观察结果显示细胞上清中的目的蛋白可装配形成直径约17nm的病毒样颗粒(VLPs);表明C端融合VP22蛋白转导域序列并不影响Cap蛋白的组装。本研究为进一步研制安全、高效的PCV2疫苗奠定基础。     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

为了获得具有天然活性的非洲马瘟病毒重组VP7蛋白,制备针对非洲马瘟VP7蛋白的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本试验通过PCR扩增、胶回收纯化后经Xba Ⅰ和Hind Ⅲ特异性酶切,将VP7基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带VP7基因的重组质粒pFastBacHTB-AHSV-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-AHSV-VP7,并在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染Sf9昆虫细胞,收获表达产物。表达产物经Western blotting分析表明,VP7重组蛋白得到表达,其分子质量大小约为45 ku,且具有良好的生物活性。     

利用杆状病毒表达系统表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

从GenBank下载传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,根据昆虫细胞偏爱密码子对IBDV VP2基因进行密码子优化,化学合成优化后的VP2基因序列,然后构建杆状病毒表达载体pTri Ex-4-VP2,构建成功的重组杆状病毒pTri Ex-4-VP2转染sf9细胞,制备病毒原种,采用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定VP2的免疫原性。结果显示:细胞感染Bac-VP2后,其细胞裂解蛋白在58 ku附近有1个条带,且该条带与IBD阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示VP2基因能在Sf9细胞中表达;动物攻毒保护试验中,2次免疫重组VP2蛋白后能诱导14日龄SPF鸡产生对IBDV强毒攻击,保护率为60%。本研究为进一步研究IBDV VP2基因工程疫苗提供了物质基础。     

IBDV抗原表位与VP2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达

运用PCR重叠延伸技术将传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位5e与VP2基因连接构建组合基因VP2-5e,将其插入到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBac HT中,转化E.coliDH10Bac感受态细胞,经三抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBac HT-VP2-5e,用脂质体法转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒vBac HT-VP2-5e。对vBac HT-VP2-5e感染的Sf9细胞,以间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;电镜检查,重组VP2-5e蛋白能够自组装成病毒样颗粒(VLP);用免疫印迹分析(Western-blotting),在59 000处出现一条特异性蛋白条带。本试验为组合基因型重组IBD多价疫苗的研究奠定了基础。     

流行性出血病病毒VP7蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

研究旨在表达流行性出血病病毒（EHDV） VP7蛋白并制备其多克隆抗体，为EHDV检测方法的建立提供材料。试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达，通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体，通过间接ELISA、Western blotting与间接免疫荧光试验（IFA）分析多克隆抗体的效价与反应原性。结果显示，在37℃与IPTG （0.1 mmol/L）的诱导下，VP7重组蛋白（分子质量46 ku）以包涵体形式高效表达，纯化与复性处理后的重组蛋白纯度达94.52%，可与不同血清型的EHDV阳性血清特异性结合。制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体效价达1∶24 000；以制备的多克隆抗体为一抗，通过IFA与Western blotting检测到EHDV感染细胞中VP7蛋白的表达。本研究在大肠杆菌中实现了EHDV VP7蛋白的高效表达，制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性与特异性，为EHDV诊断抗原的制备与血清学检测方法的建立提供了试验材料。     

蓝舌病病毒VP7基因的原核表达

为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因的原核表达蛋白,本实验采用RT-PCR方法扩增出了血清1型BTV的VP7基因,并克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,构建了重组质粒pMAL-VP7.将重组质粒转化TBl感受态细胞,以0.5 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白MBP-VP7以可溶形式存在,分子质量约为90 ku.以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了检测BTV血清抗体的间接ELISA诊断方法,为今后进一步开展BTV诊断研究奠定了基础.