鲁西地区猪胸膜肺炎放线杆菌血清型多重PCR研究

本研究建立了鉴定猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清型的多重PCR方法,并对鲁西地区流行的APP血清型进行了鉴定.根据猪胸膜肺炎放线杆菌的外膜脂蛋白(OmlA)基因设计1对种特异性引物;并且根据血清1型、5型、7型荚膜多(cps)基因设计型特异性引物,建立检测血清1型、5型、7型的PCR方法.运用多重PCR对临床分离鉴定的89株APP进行血清型鉴定,结果表明建立的多重PCR检测方法特异性和敏感性良好,可作为猪传染性胸膜肺炎快速诊断和流行病学调查的重要手段.     

猪链球菌PCR检测技术研究进展

猪链球菌是猪的一种重要病原菌,并且也会引起人的链球菌病。有35个荚膜血清型(1/21、~34),通常自发病或死亡猪体分离获得1,2,7,9型和14型菌株,其中2型是毒力最强的血清型。根据已知猪链球菌16 SrRNA及溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、胞壁蛋白或溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、胞外因子(epf)编码基因序列设计特异性引物,建立猪链球菌群和1(14),2(1/2),7型和9型特异性PCR或多重PCR,建立2型致病性菌株和1型高致病性菌株毒力鉴定PCR或多重PCR,用于检测和鉴别临床病料和细菌分离物中的猪链球菌,具有高敏感性和高特异性,与其他致病菌及其他血清的猪链球菌型无交叉反应,为疫病诊断及流行病学的研究提供了快速、简便和有用的工具。     

猪链球菌种及其主要致病血清型多重PCR检测方法的建立

根据猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因和血清型1型、2型、1/2型、7型、9型和14型的荚膜多糖编码基因核酸序列,分别设计猪链球菌种和血清型特异性引物,建立并优化多重PCR检测方法,检测分析种属背景明确的73株菌株（其中猪链球菌49株、其他对照菌株24株）及临床分离样本94株（包括四川资阳临床分离样本45株）。其中73株种属背景明确菌株多重PCR种检测结果符合率为87.5%,6种主要致病血清型检出率可达100%。24株对照菌株在种和血清型检测均为阴性。对45株四川猪链球菌病暴发现场分离菌株进行检测,其中41株为猪链球菌2型。上述结果提示建立的多重PCR方法对猪链球菌种及主要致病血清型的检测具有较好的特异性和敏感性,可用于猪链球菌病的快速诊断和流行病学调查。     

PCR鉴定沙门氏菌血清分型方法的建立与应用

为建立快速有效、经济适用的沙门氏菌血清型鉴定方法,利用Primer Plex软件设计畜禽中常见沙门氏菌的菌体(O)抗原和鞭毛抗原(H)的引物,优化引物比例和退火温度等反应条件,建立沙门氏菌血清型鉴定的PCR法,并对46株沙门氏菌分离株进行血清型鉴定,同时与传统玻片凝集法和美国CDC的液相芯片(Luminex-x MAP)法进行比较。优化后获得了O抗原中B、C1、D和E1群的多重PCR引物,以及鞭毛抗原H1相抗原基因(fli C)和H2相抗原基因(flj B)的2对引物;建立了一套基于沙门氏菌O和H抗原的多重PCR血清型鉴定法;PCR法和Luminex-x MAP法鉴定出7种沙门氏菌血清型,传统玻片凝集法鉴定出6种血清型;PCR法与传统玻片凝集法和Luminex-x MAP鉴定结果的符合率均为95.65%。本研究建立的PCR沙门氏菌血清型鉴定法简便、快速,预期可在沙门氏菌的血清分型研究中发挥作用。     

复合PCR进行胸膜肺炎放线杆菌血清型快速分型

根据胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）各血清型之间外毒素apxⅠ、apxⅡ、apxⅢ、apxⅣA基因差异，设计6对引物，对16株标准菌株进行1次5对引物的多重PCR和1次根据apxⅣA基因设计1对引物PCR的扩增，得到各血清型特异性片段，并将片段特征相同的血清型归为同一组。通过这2步PCR分组情况的不同能将16株标准菌株中的大多数血清型区别开，但是仍然不能将血清2型和8型、血清9型和11型、血清5型中的2个亚型以及血清12型和13型区分开。又根据血清2型英膜多糖（CP）基因差异设计1对引物将血清2型和8型区分开。将此分型系统应用于23株未知病原菌检测，检测到胸膜肺炎放线杆菌9株，并全部能够将其分型。本试验PCR分型体系可以作为胸膜肺炎放线杆菌血清型分型的一种快速而有效的鉴定方法。     

猪源链球菌的分离鉴定及特性

为了解猪链球菌及其血清型流行情况,对2010-2012年从河北省各地区临床病死猪分离获得的32株链球菌进行了生物学特性鉴定及血清分型。结果表明,分离的链球菌以兰氏D群为主,占34.4%,其次为C群(18.8%)。利用PCR扩增猪链球菌的种特异性16SrRNA基因以及荚膜多糖cpslI、eps2J、cps7H和eps9H基因,对32株链球菌分离株进行猪链球菌种的鉴定和分型。结果显示,属于猪链球菌的为16株,其中猪链球菌2型(SS2)为56.25%(9/16),SS7占6.25%(1/16),SS9占12.5%(2/16),其他血清型占25%(4/16)。     

利用菌落多重PCR对传染性胸膜肺炎放线杆菌进行血清分型

参照文献报道的传染性胸膜肺炎放线杆菌的特异基因合成5对特异引物,建立传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分型的菌落多重PCR方法,结果为10株传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型参考菌株均扩增出了相应的预期片段,而支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌的扩增均为阴性。利用此多重PCR方法对41株传染性胸膜肺炎放线杆菌分离菌株进行血清型分型,结果所有菌株均扩增出了相应的特异片段,其中6株为1型,5株为7型,1株为5型,29株为9型。     

猪链球菌1、7、9型多重PCR诊断方法的建立及初步应用

为了建立猪链球菌（Streptococcus suis,SS）1、7、9型（SS1、SS7、SS9）的快速鉴别诊断和分型方法,本研究根据GenBank已登录的SS1型特异性的CPS1I基因、7型CPS7H基因、9型CPS9H基因设计引物,以标准SS1、SS7、SS9株基因组DNA为模板,建立了SS1、SS7和SS9的多重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的多重PCR检测方法对11份猪链球菌的临床分离纯化菌株进行了的应用检测。结果表明,成功建立了SS1、SS7和SS9的多重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100 CFU/mL,特异性和重复性好;利用多重PCR检测方法对11份猪链球菌临床分离纯化菌株检测结果表明,11份样品中有3份样品为SS9阳性、2份样品为SS7阳性、1份样品为SS1阳性。本研究为临床上SS1、SS7、SS9的快速鉴别诊断提供了一种新方法。     

犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌荚膜血清型和基因型的研究

从石河子及附近地区规模化牛场死于肺炎的犊牛肺脏中共分离8株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),为了确定分离菌株的血清型和基因型,分别进行了多重荚膜特异基因PCR检测、脂多糖多重PCR(LPS-m PCR)分型和多位点序列分型(MLST)鉴定和分析。结果显示8株分离菌中,7株为荚膜A型,1株为荚膜B型;LPS-m PCR结果显示其中7株菌为L2,1株为L3基因型;MLST技术将8株细菌中的7株分为ST1型,1株分为ST44型,且两者亲缘关系较近。结果表明8株Pm以荚膜血清A型为主,根据LPS基因特异性将其分为2个基因型,基于管家基因的MLST将8株Pm分为两种ST型。     

副猪嗜血杆菌血清4型和13型的分子血清分型研究

为在临床诊断中快速鉴定副猪嗜血杆菌(HPS)血清4型和13型等优势流行血清型,分子血清分型方法较常规的基于特异性抗血清的血清分型方法更加准确和高效。根据HPS血清4型脂多糖合成蛋白基因wcip4和血清13型糖脂转移蛋白基因gltP序列设计特异性引物,分别建立了简便快速鉴定HPS血清4型和13型的环介导等温扩增方法(LAMP)。特异性检测结果显示,HPS血清4型或13型参考菌株检测为阳性,而其他HPS血清型参考菌株及19种其他细菌检测均为阴性;敏感性检测结果显示,在25μL反应体系中,HPS血清4型和13型基因组DNA检测限分别为1 pg和2.5 pg。对已知血清型的22株HPS临床分离株检测结果显示,13株血清4型和5株血清13型分别检测均为阳性,而其他血清型分离株检测均为阴性。结果表明,建立的LAMP方法可用于HPS血清4型和13型的快速鉴定,有助于HPS优势流行血清型的快速调查及疫苗防控。     

湖南省部分发病猪猪链球菌血清型的调查

为了解猪链球菌病在湖南病猪群中不同血清型的流行情况,实验室于2015—2017年从湖南省部分病猪群中收集到疑似链球菌感染病料142份,分别进行细菌分离,并采用猪链球菌GDH特异性引物鉴定到106株猪链球菌,阳性率为74.65%(106/142)。然后采用猪链球菌33个血清型的特异性引物对这106个菌株进行PCR鉴定,结果86.79%的菌株被鉴定到具体血清型,其中优势血清型为2型(1/2型)30.19%,其次是7型(11.32%)、8型(9.43%)和3型(6.60%)。     

猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立及应用

设计3对引物,分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因,目的片段大小分别为725bp、523bp和387bp。利用合成的3对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了多重PCR。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1105株,检出猪链球菌667株,猪链球菌2型33株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。     

SS-2、APP和PM多重PCR检测方法的建立与应用

猪链球菌2型(SS-2)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、多杀性巴氏杆菌(PM)是引起"猪无名高热症"的部分病原菌,为建立可以同时检测SS-2、APP和PM的多重PCR快速诊断方法,根据GenBank中公布的有关基因序列,设计了3对引物分别用于扩增CPS2J(SS-2),ApxIVA(APP),KMT1(PM)基因的片段。敏感性和特异性结果表明,本方法对3种病原菌的最低DNA检测量分别为48.3pg(SS-2),581pg(APP),5pg(PM),而对大肠杆菌、沙门菌、猪附红细胞体、刚地弓形虫的扩增结果均为阴性。35份临床样品的多重PCR检测结果表明,有7例SS-2,5例APP,7例PM,与生化试验的鉴定结果一致。表明所建立的多重PCR方法能够对SS-2、APP和PM单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

广东省Ⅰ型鸭疫里氏杆菌分离鉴定及PFGE分型研究

本文旨在研究广东地区Ⅰ型鸭疫里氏杆菌流行分布情况及其分子分型特点。2007—2017年,收集广东地区病死鸭、鹅的脑或肝组织等样品,进行菌株的分离、纯化及PCR鉴定等试验;采用玻片凝集的方法对鸭疫里氏杆菌进行Ⅰ型血清型鉴定,并进一步对血清Ⅰ型菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,用BioNumerics 6.0软件进行聚类分析,比较同源性。结果表明:2007—2017年本实验室共分离保存220株鸭疫里氏杆菌,其中有119株为Ⅰ型血清型,占总分离株的54.09%。PFGE分型得到33种不同的PFGE分型图谱(以相似度≥85%为判断标准),可分为19个簇及14个单一型。血清Ⅰ型是广东地区鸭疫里氏杆菌的优势血清型。Ⅰ型鸭疫里氏杆菌分子型别呈现多样化,菌株之间的同源性差异较高,但存在小范围的克隆传播。     

猪链球菌种与9型猪链球菌二重PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种与9型猪链球菌(SS9)的快速诊断方法,本研究根据GenBank已登录的SS种特异性基因gdh和SS9型特异性基因CPS9H设计引物,以标准SS9株基因组DNA为模板,建立了SS种和SS9的二重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的方法对检测疑似猪链球菌感染猪临床样品,并与常规细菌分离鉴定方法进行了比对。结果表明成功建立SS种和SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100个CFU,特异性和重复性好;利用该方法对34份临床分离自疑似猪链球菌感染样品的细菌培养物进行了应用检测试验,其中有11份样品为gdh阳性,11份gdh阳性样品中有3份样品同时为SS9阳性。本研究成功建立了SS种与SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,可用于猪链球菌种和SS9型猪链球菌的快速诊断。     

猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的鉴别诊断及血清型鉴定

利用PCR技术、琼脂扩散试验、糖发酵试验和间接血凝试验(IHA)对野外分离到的可疑猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌进行了诊断和血清型鉴定.PCR鉴定分离物HS1580为副猪嗜血杆菌,分离物HS1582为猪胸膜肺炎放线杆菌;生化试验表明分离物HS1581和HS1582为猪胸膜肺炎放线杆菌;血清型鉴定分离物HS1580不属于被检的14个血清型之列,HS1581为App血清15型,HS1582为App血清7型.试验结果表明,综合使用PCR等技术可快速、准确地对这两种传染性细菌进行鉴别诊断和血清型鉴定.     

上海屠宰样品中猪链球菌感染率调查研究

采集上海地区屠宰场中扁桃体样品,进行猪链球菌分离。按照染色特性及PCR鉴定阳性细菌。根据CPS基因采用PCR方法进行2、7及9血清型鉴定工作,并检测分离株毒力因子携带情况。结果证实在231份样品中共确定24份猪链球菌,其中2型10株、7型3株、9型2株,其余血清型待定。     

猪群中7种高发传染病多重PCR诊断方法的建立

[目的]建立猪瘟、蓝耳病(又称猪繁殖与呼吸综合征)、圆环病毒2型感染、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪多杀性巴氏杆菌感染和猪支原体感染7种猪病的多重PCR诊断方法.[方法]根据GenBank发表的核苷酸序列设计了分别针对猪瘟、蓝耳病、圆环病毒2型感染、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪多杀性巴氏杆菌感染和猪支原体感染的2套多重PCR特异性引物,优化多重PCR反应条件后进行敏感性与特异性评价.[结果]建立的2套多重PCR诊断方法对其他常见猪病痛原的基因组无特异性扩增,检测病原基因组最低浓度可达到pg级.[结论]该研究建立的2套多重PCR诊断方法可以用于猪群中上述7种猪病痛原的单一感染或混合感染的鉴别诊断.     

大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种可以同时扩增大肠杆菌(E.coli)F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因保守序列的多重PCR检测方法,本研究设计合成5对分别针对F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的特异性引物,以具有相应菌毛基因的E.coli参考菌株DNA为模板,通过对多重PCR反应条件的优化,建立了检测F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的多重PCR方法。所建立的多重PCR方法能够特异性扩增F4、F5、F6、F41、F18菌毛基因的目的片段,大小分别为770 bp、533 bp、422 bp、643 bp和1140 bp,该方法对沙门氏菌、猪丹毒杆菌、巴氏杆菌以及无菌毛基因的E.coli等参考菌株均无特异性扩增片段,检出F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的最低活菌浓度分别为5.3×10^5cfu/mL、3.7×10^6cfu/mL、3.1×10^5cfu/mL、3.7×10^7cfu/mL、6.9×10^5cfu/mL。用不同批次的引物和试剂进行3次多重PCR检测均能扩增出目的条带,表明建立的多重PCR方法有很好的批内和批间重复性。对90株大肠杆菌临床分离菌株菌毛基因进行检测,F4阳性率为3.33%,F5阳性率为2.22%,未检测到F6、F41和F18阳性菌株,其检测结果与常规单一PCR的检测结果一致。研究表明:建立的E.coli菌毛基因多重PCR分型方法具有很好的特异性、敏感性和重复性,可用于E.coli分离菌株菌毛基因型的快速鉴定,同时提高了检测效率。     

河南省猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析

为探讨河南省猪链球菌的血清型分布和耐药性情况,本试验对2016年5月~2017年5月从河南省猪场采集的各种组织病料进行猪链球菌的分离培养、生化鉴定及PCR鉴定,并进行了血清群的分群鉴定和血清型的分型鉴定,对其中的2型猪链球菌进行了药敏试验。结果显示,试验共鉴定出189株猪链球菌,流行的猪链球菌的血清群主要以D群为主,其次是G群和C群;优势的血清型是2型、7型、9型和1型。其中87株为2型猪链球菌,超过90%的2型菌株对β-内酰胺类(青霉素G、阿莫西林和头孢菌素类)、氯霉素、万古霉素、环丙沙星敏感,超过40%的2型菌株对多西环素、四环素、红霉素、复方新诺明、丁胺卡那霉素、克林霉素、链霉素、米诺环素产生耐药性。以上结果为指导猪场使用敏感药物及时控制疫情、选择血清型相符的疫苗进行预防及减少损失提供参考依据。