猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物.分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PER条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PER诊断方法.应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株.试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PER诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据.     

水牛γ-干扰素单克隆抗体的制备及其特性分析

将原核表达的重组水牛(Bubalus bubalis)γ-干扰素成熟蛋(rGST-WBIFN-γ)以100 μg/只剂量免疫8周龄Balb/c小鼠(Mus musculus),经5次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以rHIS-WB-IFN-γ和rGST-WBIFN-γ蛋白共同作为检测抗原进行间接ELISA检测,筛选并最终得到了2株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株(分别命名为IE4和4A11),分泌抗体亚型均为IgG1型,轻链均为κ链.Western-blotting检测显示:2株单克隆抗体与原核表达的rWBIFN-γ蛋白均能特异性结合,具有良好的免疫反应原性.     

双抗体夹心ELISA检测水牛γ-干扰素方法的建立及初步应用

纯化2株针对水牛γ-干扰素的单克隆抗体,其中1株进行HRP标记作为检测抗体,另1株单抗作为捕获抗体,建立检测水牛γ-干扰素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)。通过对封闭液、抗体稀释液等条件进行优化,经过方阵滴定试验确定捕获抗体的最佳浓度为625 ng/mL,检测抗体的工作效价为1∶100;所建立的DAS-ELISA方法检测灵敏度25 ng/mL,批内变异系数为0.52%～6.86%,批间变异系数为5.6%～7.07%。采集60头单次皮内注射结核菌素的水牛肝素钠抗凝全血,利用牛结核杆菌特异性抗原rHIS-CFP10/ESAT-6融合蛋白体外刺激外周血淋巴细胞释放IFN-γ,用所建立的夹心ELISA检测所有样本,与皮内变态反应试验比较,结果显示,自制夹心ELISA方法检测水牛结核病的敏感性为62%,特异性为87%,符合率为75%,表明可应用于水牛结核病的检测。     

猪链球菌9型的分离与鉴定

猪链球菌属于1987年新设立的一个种,按荚膜抗原的差异分为35个血清型,包括1~34和1/2,猪链球菌2型是其中毒力最强、最常见的一种人畜共患病〔1~3〕,猪链球菌9型也是猪链球菌病的一种重要病原,在荷兰、巴西、意大利、加拿大、法国等都有流行〔4,5〕。我国是养猪大国,随着猪规模化养殖的不断扩大,猪链球菌病也呈明显上升趋势,发病率和死亡率均较高,损失非常严重〔6,7〕。目前对猪链球菌2型研究很多,但对猪链球菌9型研究甚少,我们实验室对分离到的9型菌株进行了分子生物学鉴定。1材料和方法1.1材料1.1.1标准毒株:猪链球菌9型毒株由中国动物卫生…     

广西水牛γ干扰素基因的克隆与序列分析

提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR技术扩增水牛IFN-γ基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行测序.序列分析结果表明,获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,其开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸.与GenBank上已发表的水牛、乳牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,氨基酸同源性均高于96%;与其他种类动物的IFN-γ的同源性相比,随其亲缘关系的远近有所降低.     

猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立及应用

设计3对引物,分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因,目的片段大小分别为725bp、523bp和387bp。利用合成的3对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了多重PCR。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1105株,检出猪链球菌667株,猪链球菌2型33株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。     

广西猪伪狂犬病毒感染状况调查报告

为了解广西猪伪狂犬病毒的感染状况,应用PCR技术对来自广西46个种猪场的1940份公猪精液进行了猪伪狂犬病毒(PRV)的检测,阳性率为0;同时对广西25个已使用猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗猪场的1455份送检血清,采用了猪伪狂犬病基因缺失鉴别ELISA方法进行了血清学抗体监测,结果检出猪伪狂犬gE抗体阳性11份,阳性率为0.76%。结果表明,广西猪群中存在猪伪狂犬病野毒感染,但感染率较低。     

小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

小鹅瘟是由鹅细小病毒（Goose Parvovirus，GPV）引起的雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性、败血性传染病。该病主要侵害3～20日龄小鹅，以渗出性肠炎、肝脏、肾脏、心脏等实质器官炎症为主要特征。该病传播快，发病率和死亡率高，是严重危害养鹅业的重要传染病。     

猫杯状病毒、猫细小病毒、猫流感病毒和猫疱疹病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为建立快速检测猫科动物重要传染病的多重PCR检测方法,根据GenBank中登录的猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)、猫细小病毒(feline parvovirus, FPV)、猫流感病毒(feline influenza virus, FIV)和猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus type 1,FHV-1)的相对高保守性基因ORF2、NSP1、M和UL27,分别设计4对特异性引物。通过对反应体系的摸索及优化,建立了可同时扩增FCV(257 bp)、FPV(380 bp)、FIV(519 bp)和FHV-1(761 bp)的四重PCR反应条件及体系。结果显示：能够在同一体系中用同一反应扩增出以上4种病毒基因,其重复性及特异性均良好,敏感性可达到10 copies/μL。用该方法检测69份口鼻拭子,结果发现FCV和FPV混合感染的阳性率为10.14%,FCV和FHV-1混合感染的阳性率为1.45%,FCV、FPV和FIV混合感染的阳性率为10.14%。结果表明：研究建立的四重PCR检测方法可对常见猫科动物病毒性传染病进行快速准确的鉴别诊断,而且为...     

鹅副粘病毒病免疫程序探讨

研究先使用商品新城疫Ⅳ系弱毒苗对ND抗体检测为阴性的实验鹅进行首免和二免,再用鹅副粘病毒油乳剂灭活苗进行加强免疫。定期抽取血清用HI试验检测抗体滴度,并抽取部分有抗体滴度的鹅进行攻毒试验。结果表明:在一免后抗体滴度没有变化,而进行二免后,抗体滴度可达到3log2～4log2,加强免疫后达到10log2左右,且能抵抗强毒的攻击。