禽白血病病毒抗体间接ELISA 检测方法的建立及初步应用

以大肠杆菌表达、纯化的禽白血病病毒（ALV）重组P27蛋白为包被抗原,建立了检测ALV-P27抗体的间接ELISA方法,为禽白血病流行病学调查提供了一种简便的血清学检测方法.该方法与9种禽常见传染病病毒阳性血清及大肠杆菌阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间重复试验变异系数均小于10％,具有良好的重复性;新建立的ELISA方法比IDEXX公司生产的ALVA、B亚群抗体检测试剂盒和J亚群抗体检测试剂盒相对于免疫荧光试验（IFA）有更高的符合率.     

J亚群禽白血病ELISA抗体检测方法的建立

本研究分离纯化了具有反应活性的J亚群禽白血病JL-2株gp85表达蛋白,并以其为抗原,开展了相关反应条件、特异性、重复性、敏感性、现地应用以及国外试剂盒符合率等方面的研究,初步建立了J亚群禽白血病ELISA诊断方法.     

J亚群禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

本研究利用J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)gp85单因子血清纯化后的抗体成功建立了检测ALV-J抗原的双抗体夹心ELISA方法(DAS-ELISA)。结果表明,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,对ALV-J抗原的最小检出量为0.165 μg/mL。用该法对48份临床血浆样品进行检测,结果与PCR方法的符合率达到85.2%。     

J亚群禽白血病毒gp85基因表达及初步应用

J亚群禽白血病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）的囊膜糖蛋白GP85是亚群特异性抗原。将ALV-J的gp85基因克隆至原核表达载体pET-30a（＋）EcoRⅠ和SalⅠ两个酶切位点之间,经IPTG诱导在大肠杆菌中以His-Tag融合蛋白的形式获得了高效表达,Western blot显示该表达产物具有生物学活性。GP85蛋白经纯化、复性后免疫家兔,制备了抗ALV-J GP85的多克隆抗体。以纯化的蛋白为抗原包被ELISA检测板,对疑似血清样本进行了实验室检测,检出率较高。本研究为ALV-J的诊断和流行病学调查奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。     

禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从J亚群禽白血病病毒(ALV-J)HB09JY03株感染的DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出约720bp的gag-p27基因片段,克隆至pMD18-T载体。鉴定正确后,将该片段克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导表达。表达产物经His Trap TMHP纯化后,测蛋白浓度达到9mg/mL。用兔抗自然p27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组p27蛋白有抗原反应活性。免疫新西兰大白兔后,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组p27蛋白和多克隆抗体将在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。     

禽白血病J亚群病毒GP85蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备能够区分禽白血病A亚群和J亚群病毒的单克隆抗体,将J亚群病毒gp85基因构建到原核表达载体上,并在大肠杆菌BL21中表达携带His标签的禽白血病J亚群GP85融合蛋白,用复性纯化的融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。4次免疫后取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,经过3次亚克隆后获得1株稳定分泌针对GP85蛋白的杂交瘤细胞株,命名为386。经间接ELISA测定,小鼠腹水效价为6.4×10~5,亲和力解离常数(kD)为2.18×10~(-9),这株单抗的亚型为IgGl。通过Western Blot和IFA实验证实该株单抗是针对J亚群病毒蛋白GP85的特异性抗体。初步确定此株单克隆抗体的抗原识别区位于GP85蛋白N端的1-50位氨基酸。该株单抗的制备为ALV-J病毒抗原检测以及致病机理的研究奠定了基础。     

J 亚群禽白血病病毒gp85单抗1E3株抗原识别表位的初步分析

J 亚型禽白血病是由 J 亚群禽白血病病毒引起的一种以成髓细胞增生、免疫抑制、生长发育受阻为特点的传染性肿瘤疾病,于1988年首次发现,其病毒囊膜表面蛋白gp85决定了病毒亚群特异性.本试验将原核表达质粒pET-28a-J gp85中的gp85基因分段亚克隆至重组表达质粒pGEX-6p-1上并在大肠杆菌中成功地表达,用ALV-J Sl gp85单克隆抗体1E3株对分段表达的gp85蛋白进行初步的免疫印迹分析.结果表明:ALV-J Sl gp85单抗1E3株所识别的抗原表位位于蛋白N端的第69至112个氨基酸之间.这将为ALV-J gp85抗原决定簇所在位点及其免疫学功能的研究奠定基础.     

J亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在中国普遍存在,严重危害养禽业,暂时尚无有效预防、治疗禽白血病的措施,只能通过净化控制。因此,研究一种低成本、易推广的检测方法对防控此病非常重要。用DF-1细胞接种病毒,以细胞基因组为模板,通过巢式PCR方法扩增出941 bp的含酶切位点的ALV-J特异性基因gp85基因序列,连接于pET32a(+)载体上,实现gp85蛋白在宿主菌BL21的表达,以切胶回收方式纯化蛋白,成功获得约52 ku的重组融合蛋白,免疫新西兰兔,制备gp85单因子抗血清,Dot-ELISA检测抗体效价。结果显示,纯化所得蛋白质具有良好抗原性,制备的抗血清效价高于1.024×10⁵。本试验通过较简便、低耗的方法获得高效单因子血清,为抗血清的制备提供参考,为ALV-J gp85蛋白的研究、ALV-J特异性检测方法的研制打下基础,对ALV-J的净化有重要意义。     

K亚群禽白血病病毒多克隆检测抗体的制备和特性分析

为制备识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)兔源多克隆抗体,将含ALV-Kgp85基因的表达质粒在大肠杆菌体内进行诱导表达,获得含his标签的大小为55KD的重组蛋白;将纯化后的表达蛋白免疫接种5只青年兔,三次加强免疫后检测收获血清抗体,ELISA检测血清抗体效价;对血清抗体进行纯化并检测抗体亚型,Western-blot和IFA检测抗体对ALV-Kgp85蛋白和病毒识别特性。结果表明,获得的抗体效价达到8×10~7,抗体亚型为IgG2b,该抗体能够特异性识别ALV-Kgp85蛋白和DF1细胞中的ALVK病毒,可以用于IFA临床检测,为K亚群禽白血病的快速检测奠定了基础。     

用ALV-J gp85单克隆抗体证明蛋鸡存在J亚群禽白血病

采用免疫组化法，对病理学初步诊断为蛋用型鸡J亚群白血病的自然发病鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、心脏、胰脏、输卵管、卵巢、腺胃、骨骼肌、大脑、坐骨神经，用特异性抗J亚群禽白血病病毒(ALV—J)囊膜糖蛋白gp85的单克隆抗体进行检测，待检的组织切片中均检出阳性抗原，免疫组化的研究结果与病理学诊断结果相一致。在国内外首次发现并报道蛋用型鸡J亚群禽白血病的自然病例。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在重组杆状病毒中的表达及鉴定

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的gp85蛋白,将ALV-J的gp85基因克隆至pFastBac-HTA供体质粒,将其转入DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,使gp85基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组穿梭载体Bacmid-gp85。通过脂质体介导,将重组穿梭载体Bacmid-gp85转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp85。Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果表明ALV-J gp85蛋白在Sf9昆虫细胞中得到正确表达,表达的重组gp85蛋白分子量约为38 ku。ALV-J gp85重组蛋白在Sf9细胞中的正确表达为其功能研究和应用提供了良好的基础。     

J亚群禽白血病病毒四川株SCMS1的分离及其囊膜基因序列分析

为研究四川首例分离株SCMS1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)囊膜(env)基因是否产生新的变异,本实验通过将病毒接种鸡胚成纤维细胞、RT-PCR及PCR检测技术,对包括env基因和部分3'UTR在内的片段进行PCR扩增、克隆和序列测定.结果发现该病毒gp85基因出现6个碱基的缺失,与HPRS-103原型株6995位～7242位对应的核酸序列也发生248个碱基的缺失,包括整个rTM区域.这些碱基的缺失在病毒致病性变化中可能具有潜在的意义.     

J亚群与E亚群禽白血病自然重组病毒的全基因组序列分析

为了解我国东北地区部分养鸡场禽白血病病毒(ALV)的基因组序列特征及其变异情况,本研究从具有典型血管瘤病变的禽白血病发病鸡中分离到一株J亚群ALV(ALV-J)命名为JL0901,并进行了全基因测序.将该序列与已发表的ALV-J毒株序列进行比较研究,结果表明JL0901基因组的gag和pol基因相对保守,而env基因和3'端非编码区(3'UTR)的变异较大.对JL0901的env基因核苷酸序列进一步分析发现,在其gp85基因和gp37基因交界位置发生J亚群和E亚群ALV重组现象.本研究证实国内鸡群中存在J亚群和其他亚群ALV的自然重组现象,并表明国内ALV已出现新的变异趋势.     

J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。     

A亚群禽白血病病毒QC6281株的分离与gp85基因序列分析

本试验通过病理剖检、接种DF-1细胞、ELISA及RT-PCR检测,从北京某种鸡场的疑似禽白血病的父母代蛋鸡中分离到1株A亚群禽白血病病毒,命名为QC6281.并根据GenBank中已发表序列设计引物,扩增env基因片段并将其克隆到pMD19-T-simple 载体中,扩增的env基因片段大小为1 239 bp,其中包括完整的gp 85基因,将gp 85基因亚克隆到pMD19-T-simple载体中并测序,gp 85基因大小为1 032 bp,编码344个氨基酸.将env基因片段和推导的氨基酸序列与GenBank中9株ALV的env基因相应序列做同源性分析并制作进化树图谱.发现QC6281与已发表的A亚群禽白血病病毒株该区域核苷酸同源性在83.8%～98%,氨基酸同源性在86.9%～98.5%.其中与Myeloblastosis-associated virus type 1(L10922.1)同源性最高,核苷酸同源性为98%,氨基酸同源性为98.5%;且与Myeloblastosis-associated virus type 1(L10922.1)亲缘关系最近.本研究为该毒株的生物学特性以及致病性研究打下基础.     

J亚群禽白血病病毒安徽分离株的鉴定及其gp85基因序列分析

从安徽省的黄羽肉鸡和罗曼蛋鸡中各分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒,克隆获得了2条相应的gp85基因序列,并与参考毒株进行序列比对。结果表明,两分离毒株与J亚群参考毒株同源性为82.1%~99.4%,分离毒株之间同源性为85.4%。其中肉鸡分离毒株与J亚群原型毒株HPRS-103同源性为97.1%,与J亚群国内毒株SD09TA04、SDYC02J同源性均为99.4%;蛋鸡分离毒株与HPRS-103的同源性为89.0%,与SD09TA04和SDYC02J同源性仅为88.6%。两分离毒株的gp85氨基酸序列出现突变和缺失,在高变区hr1、hr2变异明显。进化分析进一步表明,2个分离毒株亲缘关系较远,可能来源于不同的原始病毒株。