J亚群禽白血病病毒env基因主要功能区和EGFP基因在SSff9细胞中的融合表达

为获得具备良好抗原性和生物活性的J亚群禽白血病病毒(ALV-J)env基因主要功能区的表达产物,采用特异性引物分别从保存的p MD18T-envHB2010质粒、PIRES2-EGFP中扩增ALV-J env基因主要功能区和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,酶切、连接后插入p Fast Bac Daul载体,构建杆状病毒转移载体p Fast Bac Daul-env-EGFP,将其转化DH10Bac感受态细胞制备重组杆粒Bacmid-env-EGFP,转染Sf9细胞进行真核表达。结果显示,转染了重组杆粒的Sf9细胞在倒置荧光显微镜下呈现亮绿荧光;以ALV-J单克隆抗体JE9进行Western blot检测,转染重组杆粒的Sf9细胞检测出约85 ku的条带。结果表明,目的基因在Sf9细胞中得到了良好的表达,为进一步研究ALV-J提供基础试验材料。     

鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性研究

将鸡传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株vp2基因克隆到载体pFastBac HTA中,构建重组转座载体pFVP2,然后将其转化DH10Bac感受态大肠杆菌,将vp2基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidVP2;通过脂质体转染将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacVP2。用Western blot和间接免疫荧光试验分析表明IBDV VP2蛋白在Sf9昆虫细胞获得正确表达,所表达的重组VP2蛋白分子量约50 Ku。以rBacVP2感染Sf9细胞裂解物免疫3周龄SPF鸡,在免疫后7 d可检测到ELISA抗体;免疫后14 d可检测到琼脂免疫扩散抗体。攻毒试验表明,初次免疫后14 d对IBDV超强毒株的攻击保护率为75%,2次免疫后14 d对其的攻击保护率为100%。     

J亚群禽白血病病毒SU基因与兔IgG Fc基因在Sf9细胞中的融合表达

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)SU和兔IgG Fc的融合蛋白,采用PCR方法扩增出SUJ-IgG Fc基因,并克隆至pFastBac1质粒,构建转移载体pFastBac1-SUJ-IgG Fc;再将其转化DH10BacTM感受态细胞,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-SUJ-IgG Fc;最后转染Sf9细胞,获得重组病毒rBac-SUJ-IgG Fc。免疫荧光试验结果显示,重组杆状病毒表达的融合蛋白可被ALV-J单抗JE9以及羊抗兔IgG所识别。Western blot结果显示:表达的融合蛋白与ALV-J单抗JE9以及羊抗兔IgG都有很好的反应性,其分子量大小约为95 ku。该融合蛋白的表达为鸡细胞表面ALV-J受体的研究提供了有力工具。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达

以Ⅱ亚单纯疱疹毒-2333株(HSV-2)的基因组DNA为模板扩增编码HSV-2糖蛋白D(glyco-protein D)基因,与载体pFastBacⅠ连接,转化E.coilDH5α感受态细胞,经PCR及测序鉴定正确。将pFastBacⅠ-gD重组质粒转座至DH10Bac获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白,经对表达条件进行优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功表达HSV-2 gD蛋白,为下一步的工作奠定了基础。     

VP22短肽融合猪圆环病毒2型重组病毒样颗粒的构建及其鉴定

采用融合PCR方法将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因和人单纯疱疹病毒Ⅰ型病毒(HSV-1)VP22蛋白转导域串联得到Cap-VP22基因,将其插入到杆状病毒转移载体pFastBac Dual构建pFast-Cap-VP22重组转移载体,通过转化含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含Cap-VP22基因的重组穿梭质粒rBac-2Cap-VP22。重组穿梭质粒转染昆虫细胞(Sf9),获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)、电镜观察对表达产物进行检测。结果表明,成功构建含双拷贝Cap-VP22基因的杆状病毒载体,IFA证实重组蛋白在Sf9细胞中获得正确表达,与PCV2阳性血清具有良好的反应原性;电镜观察结果显示细胞上清中的目的蛋白可装配形成直径约17nm的病毒样颗粒(VLPs);表明C端融合VP22蛋白转导域序列并不影响Cap蛋白的组装。本研究为进一步研制安全、高效的PCV2疫苗奠定基础。     

赤羽病毒G1基因的真核表达及抗原性检测

通过RT-PCR获得赤羽病毒（AKAV）OBE-1株的Gl基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的pFastBacHTA转移载体质粒中,利用Tn7转座子与穿梭我体Bacmid DNA同源重组,获得了重组杆状病毒DNA,用CELLFECTIN介导其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BAC-G1P1。SDS-PAGE结果表明,感染BAC-GIP1后的Sf9昆虫细胞表达可溶形式的120ku目的蛋白,其大小与预期相符。Western blot和间接免疫荧光试验显示表达产物具有良好的免疫学活性。     

鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。     

密码子优化的鸡白细胞介素-17在昆虫细胞中的表达研究

为了获得具有良好生物学活性且具有较高表达量的鸡白细胞介素-17(ChIL-17),本研究在前期研究工作基础上,将ChIL-17的编码基因按照真核细胞(昆虫细胞)偏爱的密码子进行优化改造,经全基因合成后插入到转座载体pFastBacTM Ⅰ中,构建重组转移质粒pfast-mod.ChIL-17并转化DH10Bac感受态细胞.通过位点特异性转座将mod.ChIL-17基因整合到穿梭质粒Bacmid中,获得重组穿梭质粒Bacmid-mod.ChIL-17.应用脂质体将重组穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-mod.ChIL-17.重组病毒传代扩增感染Sf9细胞,通过间接免疫荧光检测目的蛋白的表达.结果表明,经过优化的ChIL-17在杆状病毒系统中获得表达.     

日本血吸虫钙网织蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及其活化树突细胞的初步分析

为获得在Sf9昆虫细胞中表达的日本血吸虫钙网织蛋白(Schistosoma japonicum calreticulin protein,SjCRT)并分析其活化小鼠骨髓来源树突状细胞的功能,将构建的重组杆状病毒转移载体pFastBacHTA-SjCRT转入DH 10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-SjCRT,再转染到Sf9昆虫细胞,进行重组蛋白的表达.用Westem blot和间接免疫荧光对表达蛋白进行鉴定.His柱亲和层析法纯化表达的蛋白,Westen blot鉴定纯化后的蛋白.从BALB/c小鼠产生骨髓来源的树突细胞mDCs,用纯化的重组SjCRT蛋白与mDCs共培养,流式细胞术检测mDCs细胞的表面分子MHCⅡ、CD40和CD86的表达.结果显示,在Sf9昆虫细胞中成功表达了SjCRT蛋白;纯化后的重组SjCRT蛋白既能被感染日本血吸虫42 d的兔阳性血清识别,也能被原核表达的重组SJC RT蛋白免疫鼠的血清所识别.流式细胞术结果显示,与对照组的相比,SjCRT蛋白刺激组mDCs细胞表面分子MHCⅡ和CD86的表达量显著增强(P＜0.05).可见,在Sf9昆虫细胞中表达的SjCRT蛋白能刺激小鼠骨髓来源树突细胞表型的成熟.     

J亚群禽白血病病毒gp85蛋白的真核表达纯化及其生物学活性分析

gp85蛋白是禽白血病病毒(ALV)的囊膜表面蛋白,含有病毒-受体决定簇,通过识别和结合受体介导病毒侵入宿主细胞。为表达具有正确构象和生物学活性的J亚群ALV(ALV-J)gp85蛋白并对其生物活性进行分析,本研究以pCAGGS为载体,构建N端带有信号肽编码序列、C端融合Fc编码序列的gp85重组表达质粒pCAGGS-s-gp85-Fc,将其转染293T细胞进行瞬时表达,收集细胞培养液。SDS-PAGE结果表明,gp85-Fc蛋白高效表达,并且经Protein A亲和层析纯化得到高纯度的gp85-Fc蛋白。利用HRV 3C蛋白酶切除Fc标签并且进行分子筛纯化,得到纯度高于90%的gp85蛋白单体。经过流式细胞仪检测,表达的可溶性gp85蛋白能够与ALV-J受体特异性结合。病毒感染阻断试验结果显示,gp85蛋白能够通过封闭受体阻断ALV-J进入DF-1细胞,并且呈现剂量依赖性,在100μg/mL时仍能阻断70%以上的病毒侵入。本研究可溶性的、具有生物学活性的gp85蛋白的制备为体外研究病毒感染宿主细胞机制奠定了的基础。     

禽白血病病毒gp85蛋白在293T细胞中的表达及分析

为获得293T细胞表达的ALV-J gp85蛋白,研究通过PCR扩增ALV-J gp85基因,利用基因克隆技术克隆pMD-18T-gp85并测序,进而构建表达质粒p EGFP-N1-gp85。利用293T细胞对重组表达质粒进行表达,通过荧光显微镜和Western blot检测重组表达质粒(pEGFP-N1-gp85)的表达情况。结果显示,pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中均匀分布,说明pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达;pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达的蛋白质分子质量约为60 ku。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-gp85,并在293T细胞中获得了表达,为研制ALV-J-gp85 DNA核酸疫苗提供了科学支撑。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。     

表面展示猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)核定位序列部分缺失的ORF2基因(pdCap),将其克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的pBACsurf-1质粒中,得到重组质粒pBACsurf-1-pdCap。再将含有pdCap和gp64的融合基因克隆到杆状病毒并转移到质粒pFastBac^TM Dual中,得到重组质粒pFastBac-pdCap。然后将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到重组穿梭质粒Bacmid-pdCap。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-pdCap。间接免疫荧光和Western blotting试验结果表明,该重组杆状病毒成功表达了具有良好反应原性的pdCap蛋白。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。     

J亚群禽白血病毒gp85基因表达及初步应用

J亚群禽白血病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）的囊膜糖蛋白GP85是亚群特异性抗原。将ALV-J的gp85基因克隆至原核表达载体pET-30a（＋）EcoRⅠ和SalⅠ两个酶切位点之间,经IPTG诱导在大肠杆菌中以His-Tag融合蛋白的形式获得了高效表达,Western blot显示该表达产物具有生物学活性。GP85蛋白经纯化、复性后免疫家兔,制备了抗ALV-J GP85的多克隆抗体。以纯化的蛋白为抗原包被ELISA检测板,对疑似血清样本进行了实验室检测,检出率较高。本研究为ALV-J的诊断和流行病学调查奠定了基础。     

牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。     

伪狂犬病病毒糖蛋白gp50基因的克隆和表达

从包含伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）闽Ａ株ＢａｍＨＩ－７片段的重组质粒ｐＰＲ１２８中分离出含有完整糖蛋白ｇｐ５０基因的２．１ｋｂＤＮＡ片段，用ＫｐｎＩ和ＳｔｕＩ酶切后，将其酶切片段分别克隆到ｐＵＣ１９载体中，构建了２．１ｋｂ片段完整测序用质粒。对其序列进行分析，发现与文献报道结果一致，证明分离的ｇｐ５０基因是正确的。将包含ｇｐ５０基因的２．１ｋｂ和１．６ｋｂＤＮＡ片段分别插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ基因区段的ｐＧＪＰ－５质粒Ｐ７．５启动子的下游，构建了ｐＧＢＴ５０－３６和ｐＧＢＴ５０－Ｓ２２个嵌合载体。将嵌合载体通过磷酸钙共沉淀法转染预先感染ＴＫ＋痘苗病毒天坛株的人ＴＫ－１４３细胞或ＣＶ－１细胞，进行体内同源重组。经蚀斑纯化，在ＢｄＵＲ选择压力下，通过光敏生物素标记的探针杂交，获得带有ＰＲＶｇｐ５０基因的重组痘苗病毒。用ＥＬＩＳＡ检测，重组痘苗病毒有特异性ＰＲＶｇｐ５０抗原存在。     

J亚群禽白血病毒gp85基因克隆表达与初步应用

在本实验室分离鉴定J亚群禽白血病病毒的基础上,用PCR方法扩增gp85基因,长度为921 bp的DNA片段,与J亚群禽白血病标准毒株序列比对同源率为96.4%。将该片段连接到pET28a表达载体上,构建了重组表达质粒pET28a-S1-Jgp85,对质粒测序后分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为40 kD的融合蛋白。Western blot结果表明,表达产物可以与ALV-J阳性血清发生特异性反应。以纯化的His-Jgp85重组蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法,用于J亚群禽白血病的临床诊断。本研究对抗原包被浓度,待检血清稀释浓度,酶标抗体浓度,特异性试验及临界值等条件进行优化,对优化后的ELISA检测方法进行了临床应用试验。本研究建立了能特异性检测J亚群禽白血病血清抗体的ELISA方法。     

J亚群禽白血病Hrb-1分离株env基因克隆及gp85杆状病毒表达载体的构建

自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT-PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS-103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取质粒分别用HindⅢ,BamHI进行单酶切和双酶切鉴定,得到了阳性重组质粒pMD18-T-Hrb-1/env,对其进行Pst Ⅰ酶切,回收包含J亚群禽白血病病毒株Hrb-1 gp85基因的997bp片段,应用Bac to Bac杆状病毒表达系统,将外源片段与线性化的杆状病毒载体pFast Bac HTA进行连接,获得重组载体pFAST BacHTA/gp85,将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得了杆状病毒重组载体Bacmid/gp85,为表达gp85并建立适于国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础.     

表达Ag85基因重组卡介苗的构建

为研发一种更安全、有效的结核病疫苗,用于预防并清除结核病,本试验构建4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,参考pMV261载体序列和Tuberculist上登录的H37Rv序列设计引物,通过PCR扩增和无缝克隆技术构建含Ag85基因片段的重组pMV261质粒。分别对重组质粒进行PCR、双酶切鉴定后,通过电击转化转染到卡介苗感受态细胞中,利用Kan耐药基因筛选获得重组卡介苗菌株。采用PCR及Western blotting鉴定Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因在卡介苗中的表达,再对构建成功的重组卡介苗进行培养,用于后续试验。PCR扩增结果表明,构建的重组卡介苗rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C和rBCG/Ag85D目的基因片段大小分别为1 447、1 402、1 453和1 330 bp,与预期大小一致,表明目的基因已成功整合到卡介苗中;Western blotting结果表明,Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因均可在卡介苗细胞内成功表达。本试验利用基因工程技术成功获得4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,将其分别命名为rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C、rBCG/Ag85D。本研究可为进一步将其他抗原基因插入卡介苗细胞构建重组疫苗及疫苗研究提供材料。