Dot—ELISA检测猪生殖和呼吸综合征抗体的研究

用差速离心法提纯ＰＲＲＳ病毒，利用ＮＣ膜作为载体，在国内外首次成功建立了检测ＰＲＲＳ血清抗体的斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）。抗原包被浓度为１００μｇ／ｍｌ，被检血清工作浓度为１：１０，酶标兔抗猪ＩｇＧ工作浓度为１：６００。对７２份北京地区猪血清分别用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和ＩＦ检测，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测阳性率为３３．３％，ＩＦ检测阳履率为３０．６％，与ＩＦ符合率较高，对部分待检血清检测     

间接法Dot—ELISA检测鸡减蛋综合症抗体的建立及应用研究

应用ＳｅｐｈａｄｃｘＧ－２００层析法纯化鸡减蛋综合症病毒，利用ＮＣ膜作为载体，成功建立了检测ＥＤＳ－７６血请抗体的斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）。抗原包被浓度为２μｇ／ｍｌ，被检血清浓度为１：２０，酶标兔抗鸡１ｇＧ浓度为１：２００．底物溶液最适ｐＨ值为７．２。对Ａ－Ｆ６个养禽场随机抽检血清１６０份，分别用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ、ＨＩ和ＡＧＰ检测，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检出阳性率为５１．９％，ＨＩ检出阳性率为４６．９％，ＡＧＰ检出阳性率为３１．９％。对１４０日龄鸡人工感染试验，测定抗体消长规律。本方法不需特殊仪器。适用于基层兽医部门和养鸡场对ＥＤＳ－７６的血清学诊断和流行病学调查。     

Dot─ELISA检测猪生殖和呼吸综合征抗体的研究

用差速离心法提纯ＰＲＲＳ病毒，利用ＮＣ膜作为载体，在国内外首次成功建立了检测ＰＲＲＳ血清抗体的斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）。抗原包被浓度为１００μｇ／ｍｌ，被检血清工作浓度为１∶１０，酶标兔抗猪ＩｇＧ工作浓度为１∶６００。对７２份北京地区猪血清分别用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和ＩＦ检测，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测阳性率为３３．３％，ＩＦ检测阳性率为３０．６％，与ＩＦ符合率较高，对部分待检血清检测结果表明：６１份１９９１年进口美国猪血清阳性率为０％，１８２份１９９５年进口加拿大猪血清阳性率为４．９４％。本法不需特殊仪器，适用于基层兽医部门和猪场对该病的血清学诊断和流行病学普查     

用PPA-ELISA检测鸡痘病毒抗体的研究

建立了检测鸡痘病毒抗体的ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ。用该法检测７５份鸡血清样品，鸡痘病毒抗体检出率（２１．３３％）高于琼脂扩散试验（１０．６７％）。经血清抗体吸收和重复性试验，证明ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ法具有特异性强和重复性好特点。此外，对４种封闭液的封板结果表明：１０％犊牛血清ＰＢＳ／Ｔ效果最好，次之为０．２５％白明胶ＰＢＳ／Ｔ、０．５％牛血清白蛋白ＰＢＳ／Ｔ、０．１％牛血清白蛋白ＰＢＳ／Ｔ。     

用PPA—ELISA检测鸡痘病毒抗体的研究

建立了检测鸡痘病毒抗体的ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ，用该法检测７５份鸡血清样品，鸡痘病毒抗体检出率（２１．３３％）高于琼凝扩散试验（１０．６７％），经血清抗体吸收和重复性试验，证明ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ法具有特异性强和重复性好特点，此外，对４种封闭液的封板结果表明，１０％犊牛血清ＰＢＳ／Ｔ效果最好，次之为０．２５％白明胶ＰＢＳ／Ｔ，０．５％牛血清白蛋白ＰＢＳ／Ｔ，０．１％牛血清白蛋白ＰＢＳ／Ｔ。     

鸡传染性法氏囊病双抗体夹心Dot─ELISA诊断法的建立及应用

以醋酸纤维素膜作为固相载体，辣根过氧化物酶标记鸡抗传染性法氏囊病病毒抗体（ＩＢＤ—ＩｇＧ），饱和二氨基联苯胺为底物显色，建立了鸡传染性法氏囊病双抗体夹心Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ诊断法。经方阵实验确定最佳反应条件为：ＩｇＧ的包被液为０．０５ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ９．６）碳酸盐缓冲液，包被浓度为１：５０；酶标抗体的工作浓度为１：１００；洗涤液为含０．０５％吐温—８０的０．０２ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）磷酸盐缓冲液；封闭液为含０．２％明胶的洗涤液；封闭时间、抗原及酶标抗体的作用时间均为３７℃３０ｍｉｎ。应用本方法和琼扩试验同步检测２０份已知阳性病料、１２０份待检病料和胚毒尿囊液、１０份正常鸡样品，结果表明，Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ阳性率为９０％，而琼扩试验为４０％；凡琼扩试验阳性者，Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ均呈强阳性，而在Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ阳性样品中，只有４４％呈琼扩试验阳性，Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ的敏感度为琼扩试验的１００倍。     

非洲猪瘟间接ELISA诊断试剂盒的研究

用带有编码非洲猪瘟病毒衣壳蛋白Ｐ７２ 基因的重组杆状病毒（Ｂａｃｐ７２）作载体,在ｓｆ９细胞中表达并得到重组Ｐ７２蛋白,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ可得到分子量在 ７２ｋＤａ左右的电泳带。用标准阳性非洲猪瘟血清对 Ｐ７２蛋白进行 ＥＬＩＳＡ检测,证明该蛋白具有生物学活性。用Ｐ７２作为间接法的包被抗原,对ＥＬＩＳＡ反应条件进行了优化。确定最佳包被液为ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、最佳封闭液为１％ＰＣＴ、最佳血清稀释液为４％ＰＥＧ６０００／ＰＢＳ、最佳冲洗液为０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）。本实验反应体系采用５０μｌ的微量法,可节约试剂及抗原。反应在２小时内即可完成,达到了快速诊断的目的。包被了抗原并用封闭液封闭后的酶标板密封后保存于－２０℃的冰箱中,至少可以保存５个月。阻断试验和交叉试验表明ＥＬＩＳＡ法有良好的特异性。间接ＥＬＩＳＡ比Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法具有更高的灵敏性。血清学调查没有得到阳性结果,与我国实际情况相符。用Ｂａｃｐ７２表达的非洲猪瘟病毒Ｐ７２蛋白抗原作为间接ＥＬＩＳＡ的检测抗原来检测非洲猪瘟血清具有快速、简单、无感染的特点。本实验为非洲猪瘟ＥＬＩＳＡ检测试剂盒的最终组装提供了实验依据。     

鸡传染性法氏囊病诊断试剂盒的研制

采用鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）病毒（ＩＢＤＶ－２５１２）研制了检测ＩＢＯＶ抗体的ＥＬＩＳＡ试剂盒。抗原最佳包被浓度为５．１２μｇ／ｍｌ，被检血清最佳稀释度为１：２００，酶标结合物最佳工作浓度１：１０００．本试剂盒与美国ＫＰＩＩＢＤ－ＥＬＩＳＡ试剂盒比较，结果敏感性、特异性、重复性均达到美国同类产品水平，且易于操作．在４℃可稳定保存６个月、对北京地区４个非免疫鸡群的１０３只鸡测得其阳性率为５４％，对４５只ＳＰＦ鸡的阳性率为０％。     

马杜霉素在鸡组织中残留检测方法的研究 Ⅱ 免疫亲合色谱—酶联免疫吸附法(IAC—ELISA)

本文首次报道ＩＡＣ—ＥＬＩＳＡ方法测定鸡组织中马杜霉素的残留。制备针对马杜霉素的特异性抗体ＩｇＧ和高容量ＩＡＣ柱（Ｉ柱动态柱容量为７ １６０ｎｇ·ｍｌ－ １ｇｅｌ,Ⅱ柱为３ ７５０ｎｇ·ｍｌ－ １ｇｅｌ） 。组织样品用甲醇提取,经ＩＡＣ柱分离纯化,ＥＬＩＳＡ检测,即ＩＡＣ—ＥＬＩＳＡ 方法。本试验揭示,以组织样本提取纯化稀释液为介质制备的标准曲线（Ｉ５０ 为３３３ ～３７１ｎｇ·ｍｌ－ １ ,斜率为１９５ ～２２０ ,检测极限为１０ ～２８ｎｇ·ｇ－ １） ,其Ｉ５０ 值和斜率与以ＰＢＳＴ－ １０ ％ 甲醇为介质的标准曲线相符,实际ＩＡＣ—ＥＬＩＳＡ检测时,各组织的标准曲线可用后者代替,使操作大为简化、实用。各组织添加马杜霉素３００ ～１２０ ．０μｇ·ｋｇ － １ 水平下,测得样本回收率为７６４ ％ ～１０９ ．０ ％ ,变异系数为３８ ％ ～１６ ．４ ％ 。结果证明了该方法的可靠性。本文建立的ＩＡＣ—ＥＬＩＳＡ法是目前国内外唯一报道的最简便、灵敏的马杜霉素残留检测方法。     

ABC—Dot—ELISA检测鸡传染性支气管炎病毒

建立了ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）的方法,其最佳反应条件是：包被液为０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ９．６的碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液（ＣＢＳ）,免疫ＩＢＶ ＩｇＧ的最佳工作浓度为１：８０;抗原的最佳浓度为１：８００;封闭剂选用０．０１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．４含３０ｍＬ／Ｌ白明胶的ＰＢＳ,Ｂ－ＡｇＧ和ＡＢＣ－ＨＥＰ的最佳工作浓度为１：２００。用ＡＢＣ－ＨＥＰ的最佳工作浓度为１：２０     

单抗夹心ELISA检测产蛋下降综合征病毒的研究

利用３株特异性单抗,建立了检测ＥＤＳＶ的夹心ＥＬＩＳＡ方法。经测定,ＭｃＡｂ最适包被浓度为２μｇ／ｍｌ,ＭｃＡｂ－ＨＲＰ最佳工作浓度为１∶４００,该方法最小检出浓度为０．０３μｇ／ｍｌ,与常见的几种鸡的传染病的病原无交叉反应。对某发病鸡场的５０份泄殖腔拭子样本进行了检测,阳性率为８４％（４２／５０）。     

禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究

用表达禽流感病毒（ＡＩＶ）核蛋白基因的杆状病毒感染Ｓｆ９昆虫细胞。以其表达产物制备抗原,建立了以杆状病毒系统表达的ＡＩＶ核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ）。其抗原最适包被量为０．６μｇ／孔,等检血清最适稀释度为１：２００,酶标抗体使用浓度为１：１０００。根据对１４０份ＳＰＦ鸡血清检测结果的统计分析,确定其判定标准为ＯＤ均为阴性;检测Ａ型ＡＩＶ１５个不同亚型（Ｈ１￣Ｈ１５）毒株的特异性血清均为阳性;对人工接种ＡＩＶ的ＳＰＦ鸡第３天即能检出抗体,到第１６２天试验结束时检测仍为阳性。其批内和批间重复试验的变异系数分别在２．９％￣７．２％和３．４％￣９．８％之间。对３１３８份鸡血清进行监测,ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ（ＡＩＶ－ＥＬＩＳＡ）、琼脂扩散     

Ab─ELISA和Ag─ELISA诊断骆驼伊氏锥虫感染的比较

采用四种方法：即①单克隆抗体检测抗原的酶联免疫吸附试验（Ａｇ－ＥＬＩＳＡ）②检测抗体的酶联免疫吸附试验（Ａｂ－ＥＵＳＡ）③表膜检查（ＢＣＥ）④小白鼠接种（ＭＩ），检查了肯尼亚１８３头骆驼锥虫的循环抗原，ＢＣＥ查出３７头阳性２０％），ＭＩ６０头阳性（３３％），Ａｇ－ＥＬＩＳＡ６３头阳性（３４％），Ａｂ－ＥＬＩＳＡ检出９０头阳性（４９％）。其中ＢＣＥ未能检出的２４头中，Ａｇ－ＥＬＩＳＡ检出１８头（７５％）。所有阳性头数中，Ａｇ－ＥＬＩＳＡ检出９３％，Ａｂ－ＥＬＩＳＡ９５％。根据５５头的结果，阳性与阴性之间Ａｇ－ＥＬＩＳＡＯＤ值差异极显著（Ｐ＜０．０００１），Ａｂ－ＥＬＩＳＡＯＤ值差异不显著。因此，用Ａｇ－ＥＬＩＳＡ或结合ＢＣＥ诊断伊氏锥虫感染比用ＡＢ－ＥＬＩＳＡ更理想。     

酶联免疫吸附试验检测猪生殖与呼吸综合征抗体的研究

建立的检测猪生殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）抗体的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），其抗原包被浓度为１．７ｍｇ／Ｌ，血清的最适稀释度为１：１００，酶标兔抗猪ＩｇＧ的家访工为１：２０００。比较试验表明，ＥＬＩＳＡ的敏感性优于间接免疫荧光试验（ＩＦＡ）。用ＥＬＩＳＡ检测１９９１年从美国进口猪的血清７６份，阳性率为零；１９９５年从加拿大进口猪的血清１６３份，阳性率为５．５２％；北京地区甲猪场的血清１２１份，阳     

ELISA检测兔巴氏杆菌病抗体的研究

应用ＥＤＴＡ处理和超声波裂解法提取多杀性巴氏杆菌的荚膜多糖和外膜蛋白抗原，包被酶标板，用ＨＲＰ－ＳＰＡ代替酶标抗体，建立了检测兔多杀性巴氏杆菌病抗体的间接法ＥＬＩＳＡ。试验确定抗原的包被浓度为６．０５μｇ／ｍｌ，ＨＲＰ－ＳＰＡ的适宜稀释度为１１００００，血清ＥＬＩＳＡ滴度在１４００以上判为阳性。测定了多杀性巴氏杆菌灭活菌苗免疫兔血清１０份，均呈阳性，抗体滴度在１１２８０～１４０９６０范围内呈正态分布；血清几何平均效价为１５１２０。重复４次测定１０份阳性血清，其ＯＤ值之标准差（ＳＤ）＜０．１０，变异系数（ＣＶ）＜１０．０％。本法与琼脂扩散沉淀试验相比，敏感度提高约１５７５倍。ＥＬＩＳＡ不仅敏感、特异、快速、简便，而且经济、易于重复，适于推广应用。     

鸡白血病病毒抗原ELISA试剂盒的研制和应用

以双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）为基本原理，成功地研制出鸡白血病病毒抗原ＥＬＩＳＡ试剂盒，该试剂盒与国外同类试剂盒相比，具备相同的特异性和敏感性，对ＲＡＶ－１纯化样品的最小检出量可达０．７８ｕｇ／ｍｌ，且敏感性高于直接补体结合试验。经初步应用发现，我国商品种鸡群ＡＬＶ阳性率为０．７－１４％，在部分ＳＰＦ鸡群中未检出阳性鸡。     

用ELISA检测山羊关节炎脑炎病毒抗体

以差速离心，结合ＳＤＳ处理制备ＥＬＩＳＡ抗原，用含０．０２％ＮａＮ３的碳酸盐缓冲液作抗原包被液，不加任何封闭剂，待测血清以含５％犊牛血清和０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０稀释，检测９２２份山羊血清的ＣＡＥ抗体，并与免疫扩散试验（ＡＧＩＤ）比较，提高检出率约一倍并减少漏检     

鸡传染性法氏囊病双抗体夹心Dot—ELISA诊断法的建立及应用

以醋酸纤维素膜作为固相载体，辣根过氧化物酶标记鸡抗传染性法氏囊病病毒抗体，饱和二氨基联苯胺为底物显色，建立了鸡传染性法氏囊病双抗体夹心Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ诊断法，经方阵实验确定最佳反应条件为：ＩｇＧ的包被液为０．０５ｍｏｌ／Ｌ（ＰＨ９．６）碳酸盐缓冲液，包被浓度为１、５０；酶标抗体的工作浓度为１；１００；洗涤液为含０．０５％吐温－８０的０．０２ｍｏｌ／Ｌ（ＰＨ７．４）磷酸盐缓冲液；封闭液为含０．２％     

检测EDS76病毒抗体Dot—ELISA方法建立的及应用

建立了检测ＥＤＳ７６病毒抗体Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法。待检血清最适稀释度为１∶１０,ＥＤＳ７６病毒ＤＥＦ细胞培养物最佳工作浓度为１∶５,ＨＲＰ－ＭｃＡｂ工作浓度为１∶４００。所建方法与常见几种鸡的传染病血清无交叉反应,１２０份临床样本中检出６６份阳性。     

鸡新城疫,减蛋综合征和肾型传染性支气管炎三联油乳剂灭活苗的研制和 …

采用Ｌａｓｏｔａ种毒和ＮＩＢＶ同胚接种，ＥＤＳ－７６种毒鸭胚培养的方法研制了ＮＤ－ＥＤＳ－７６－ＮＩＢＯＥＶ，并依据有关标准进行了安检和效检试验，３０日龄雏鸡接苗１毫升／只，临床无不良反应；接苗０．０２毫升／只，２１天后ＮＤ攻毒保护率为１００％，接苗０．２毫升／只，２１天后ＮＩＢ攻毒保护率为８０％，接种０．５毫升／只，２天天后采血测ＥＤＳ－７６ＨＩ抗体ＧＭＴ为２２２．８试验结果表明本疫苗安全，有效