抗水牛伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原单克隆抗体的研制

用纯化的伊氏锥虫变异表面糖蛋白（variant surface glucoprotein, VSG）免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过3次克隆和间接ELISA方法筛选,获得3D7、5B9 2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养液上清效价和小鼠腹水效价,其中细胞培养上清效价分别为1∶6400和1∶12800,腹水效价分别为1∶105和1∶106。单抗的亚型鉴定结果表明,3D7、5B9分泌的抗体都为IgG1亚类κ链。     

牛干扰素单克隆抗体的制备与初步鉴定

通过IPTG诱导的大肠埃希菌表达重组牛干扰素-γ融合蛋白(BovIFN-γ),利用GlutathioneSepharose 4 Fast Flow亲和层析柱进行融合蛋白的纯化,纯化后的融合蛋白BovIFN-γ作为抗原免疫Balb/c小鼠,经5次免疫后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,间接ELISA筛选,有限稀释法克隆亚克隆获得分泌BovIFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过ELISA方法对其抗体效价、特异性、亚类及稳定性进行鉴定。获得一株稳定分泌BovIFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株A12E9,细胞培养上清和腹水效价可达1∶3 200和1∶160 000。     

磺胺氯吡嗪钠单克隆抗体的制备及鉴定

应用重氮化方法制备了磺胺氯吡嗪钠(sulfachloropyrazine sodium,SPZ)完全抗原SPZ-OVA,将成功偶联的人工全抗原(SPZ-OVA)免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,经间接ELISA检测,1号小鼠血清抗体效价达到1:6.4×104。取该小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。利用ELISA方法对融合后的杂交瘤细胞上清进行检测,筛选出能够稳定分泌抗体的细胞株:D9。将细胞株D9扩大培养后,经腹腔注射小鼠使其产生腹水。腹水单抗经纯化后,通过间接竞争ELISA对该单克隆抗体的效价、半数抑制浓度以及特异性进行检测。结果表明,所制备的单克隆抗体效价为1:4×105,半数抑制浓度为326 ng/m L,特异性良好。     

抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒P32蛋白为免疫原,构建杂交瘤细胞株,制备P32蛋白单克隆抗体。用纯化的P32蛋白免疫BALB/C小鼠后,按常规方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒P32蛋白的杂交瘤细胞,制备P32蛋白单克隆抗体,获得4株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在105以上。山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备为进一步开展检测方法研究提供了材料。     

牛初乳免疫球蛋白IgG单克隆抗体的制备

为了制备牛初乳免疫球蛋白IgG单克隆抗体,试验利用标准IgG蛋白作为免疫原,免疫6周龄Balb/c雌性小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA法筛选,采用有限稀释法,经过3次克隆筛选,获得2株稳定分泌抗IgG蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为E7和D9,并进行了亚类鉴定。结果表明:该杂交瘤细胞培养上清液抗体效价抗体效价E7为1∶3.01×103,D9为1∶5.24×104;腹水抗体效价E7为1∶2.52×105,D9为1∶7.01×106;E7和D9分泌的单克隆抗体均为IgG1型,轻链为λ链抗体。     

马绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

本研究采用马绒毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin,eCG)纯品免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1∶10融合,间接酶联免疫吸附法(ELISA)筛选阳性克隆和有限稀释法克隆,扩大培养后于小鼠腹腔制备腹水,共得到8株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用间接ELISA测定抗体效价,效价均达10^-5以上。用获得的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体,为eCG分泌水平的ELISA检测方法的建立确立了条件。     

山羊痘病毒ORF122蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒ORF122蛋白为免疫抗原,构建杂交瘤细胞株,制备ORF122蛋白单克隆抗体。用纯化的ORF122蛋白免疫BALB/c小鼠后,按通用的方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒ORF122蛋白的杂交瘤细胞,制备ORF122蛋白单克隆抗体,获得6株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在104以上。山羊痘病毒ORF122蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备,为山羊痘病毒的进一步研究提供了生物材料。     

鸭疫里默氏杆菌pfs基因的克隆表达及单克隆抗体制备

将鸭疫里默氏杆菌的pfs基因进行原核表达,重组蛋白经纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株。通过间接ELISA法测定腹水效价、Western blot法检测其免疫反应性,并鉴定抗体的亚型。重组蛋白SDS-PAGE检测结果验证得到26 k Da Pfs蛋白,免疫小鼠后最终获得1株阳性杂交瘤细胞株,命名为2E2E6,为Ig G1亚类,间接ELISA法检测腹水效价为1:64 000。Western blot结果表明制备的单克隆抗体具有良好的免疫反应性。本研究成功制备了Pfs的单克隆抗体,为进一步研究Pfs在鸭疫里默氏杆菌中的作用提供了参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性分析

分别用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb)。用纯化的PRRSV免疫小鼠,经细胞融合获得2株可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4B8、4D8。用重组N蛋白免疫的小鼠,经细胞融合获得3株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞2F3、4D5、5D11。间接ELISA检测4D8、4B8、4D5和5D11杂交瘤上清效价为1∶32~1∶512,而2F3的腹水效价为1∶12 800。单抗2F3、4B8和4D8与纯化病毒的Western blotting反应都为阳性,而4D5和5D11为阴性。IFA检测结果5株单抗都有明显的荧光,与PRRSV呈阳性反应。2F3的Ig亚型为IgM。5株单抗杂交瘤细胞连续传代至20代,分泌相应McAb的效价基本一致。本研究为PRRSV生物学诊断和方法研究提供有用工具。     

鸭呼肠孤病毒p18重组蛋白表达、纯化及其单克隆抗体制备

研究旨在制备DRV p18蛋白单克隆抗体。试验通过原核表达并纯化DRV p18重组蛋白,经BCA蛋白浓度测定后免疫BALB/c小鼠;通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,获得的p18单克隆抗体通过ELISA、IFA和Western blot试验进行鉴定,并将杂交瘤细胞腹腔注射小鼠获得单抗腹水,通过Western blot试验验证其特异性。结果显示：纯化的重组p18蛋白浓度为1.37 mg/mL,经过三轮亚克隆获得4株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3、2C4、4A2和4D4,亚型鉴定1E3和4D4重链为IgG1型、2C4重链为IgM型、4A2为IgG2b型,轻链均为κ型;4株单克隆抗体均能使感染DRV的BHK-21细胞发出特异性荧光,并在18 ku处存在特异性条带;4D4腹水ELISA效价为1∶409 600,Western blot效价达1∶102 400,IFA效价为1∶51 200;4D4与DRV反应,而不与其他禽源常见病毒反应。研究成功制备了抗DRV p18蛋白的单克隆抗体,为进一步研探究p18蛋白的功能奠定基础。     

副猪嗜血杆菌OMP5单克隆抗体的制备与鉴定

用副猪嗜血杆菌（HPS）血清5型灭活菌液免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以HPS外膜蛋白5（OMP5）为抗原,经间接ELISA法筛选阳性融合孔,并用有限稀释法对筛选的阳性孔进行亚克隆,获得2株分泌抗HPS OMP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E2和8D9;间接ELISA法效价检测,1E2和8D9细胞培养上清抗体效价均为1∶2 560,纯化后腹水抗体效价分别为1∶204 800和1∶51 200;抗体型别鉴定,1E2和8D9分别分泌IgG2b、IgG2a型抗体;特异性检测表明,2株单抗均能特异识别OMP5。将2株杂交瘤细胞反复冻融3次复苏后仍能稳定分泌抗体。2株抗HPS OMP5单克隆抗体的成功制备,将为HPS感染快速检测方法的建立以及检测试剂的研制奠定基础。     

水泡性口炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

将水泡性口炎病毒（VSV）经差速离心和蔗糖密度梯度离心法进行纯化后,以纯化的VSV作为免疫原免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对制备出的抗VSV单抗的特异性、抗体亚类等生物学特性进行鉴定。结果显示,试验成功筛选出2株能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A2、4C3。ELISA鉴定结果表明,2株单抗均能特异性地与VSV结合,而与口蹄疫病毒（FMDV）、猪水泡病病毒（SVDV）均不发生交叉反应;诱生小鼠腹水产生的抗体效价可达1∶25 600～1∶51 200。杂交瘤细胞染色体核型鉴定结果显示,杂交瘤细胞染色体数为95～105,均高于2个亲本细胞的染色体数目,说明这2株细胞是两者的杂交产物。抗体亚类鉴定结果显示,所获得2株单抗1A2、4C3均为IgG1。Western blot分析结果表明,1A2可识别VSV G蛋白。2株抗VSV单克隆抗体的成功制备将为VSV快速检测方法的建立以及检测试剂的研制等奠定基础。     

抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本试验旨在为PCV2的快速诊断提供技术手段。用纯化的原核表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(pET-Cap)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了2株能够稳定分泌抗pET-Cap抗体的杂交瘤细胞株3D5和5C5。经建立的间接ELISA试验检测3D5、5C5细胞上清效价分别为1∶2048、1∶1024;诱生腹水的效价分别为 1∶204800、1∶102400,杂交瘤染色体数目分别为95条、96条。Western blotting结果表明,2株单抗能与病毒发生特异性反应。传代培养20代,3个月内复苏冻存3次,3D5、5C5能够稳定分泌抗体。     

虾源副溶血性弧菌PirB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

用杆状病毒表达系统表达虾源副溶血性弧菌编码蛋白PirB的重组蛋白,用SDS-PAGE、Western blot对其进行鉴定,纯化后的PirB重组蛋白免疫Balb/c小鼠后进行细胞融合,通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,用ELISA方法对单克隆抗体进行测定。结果发现,共筛选到7株能够稳定分泌抗PirB蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,小鼠腹水的效价最高效价达到1∶2.56×106,制备的单克隆抗体可以特异性识别PirB蛋白,表明成功制备了虾源副溶血性弧菌PirB蛋白单克隆抗体,为虾源副溶血性弧菌引发的疾病诊断奠定了基础。     

抗H3N2亚型猪流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

采用纯化的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)尿囊液作为免疫原免疫6～8周龄Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法筛选分泌抗SIV-H3N2的阳性细胞株,经克隆获得7株亲和力较高的杂交瘤细胞株,分别命名为1C9、2C5、2F10、3D3、4E8、5C7、5D12,用其制备的腹水ELISA效价可达1×106。通过抗体亚型测定,间接免疫荧光试验及免疫印迹试验分析鉴定,该7株单抗均为抗H3N2亚型SIV的特异性单克隆抗体,而且与其他亚型猪流感病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒等均无交叉反应,为H3N2亚型SIV的鉴别诊断奠定了基础。     

抗猪附红细胞体单克隆抗体的制备

以纯化的猪附红细胞体免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并用间接ELISA方法进行筛选,经过间接ELISA方法、免疫印迹和间接免疫荧光试验进行鉴定,共获得5株分泌抗猪附红细胞体单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1H1、1H2、3A5、5B1和7E11,其单抗亚类鉴定分别属于IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b和IgG2b。这5株McAb均能与猪附红细胞体全菌蛋白发生特异性反应,而不与猪肺炎支原体、猪链球菌、大肠杆菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒发生反应,并且1H1、3A5和5B1能识别同一抗原位点,1H2和7E11识别另一抗原位点。     

新城疫病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV） M蛋白单克隆抗体,本研究将编码该蛋白的基因克隆、表达并纯化重组蛋白,作为免疫原免疫小鼠,同时建立ELISA筛选方法对小鼠血清效价进行测定,筛选出血清抗体效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,最终获得能稳定产生NDV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行了抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定、杂交瘤细胞染色体计数、小鼠腹水制备及腹水内单克隆抗体效价测定。结果显示,PCR、重组质粒测序及双酶切鉴定正确,M基因大小约为1 095 bp。SDS-PAGE和Western blotting检测显示,试验成功表达了重组M蛋白,分子质量约为60 ku,且可与NDV阳性血清反应。建立的ELISA筛选方法中,重组M蛋白、His标签蛋白和抗体的最佳工作浓度分别为0.5 μg/mL、0.5 μg/mL和1∶256 000。抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定显示,杂交瘤细胞产生的抗体可与NDV SG10株及重组M蛋白特异性结合,其轻链为κ,重链为IgG2A。C9-G2、D3-F2杂交瘤细胞染色体计数结果分别为97和101条;杂交瘤细胞上清的ELISA检测效价均为1∶6 400,腹水的ELISA检测效价分别为1∶409 600和1∶102 400。本研究成功制备了NDV M蛋白的单克隆抗体,可为进一步研究M蛋白的功能提供工具。     

犬瘟热病毒截短P蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)P1蛋白的单克隆抗体(McAb),本研究利用重组犬瘟热病毒P1蛋白免疫BALB/c小鼠,并将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,用CDV包被ELISA板,通过间接ELISA法筛选出两株稳定分泌抗CDV-P1的杂交瘤细胞株(E9E4C10、E9F8D9)。间接ELISA检测腹水效价均为1∶10⁶,亚类鉴定结果均为IgG2b。Western blotting和间接免疫荧光(IFA)分析结果表明,两株单克隆抗体均能与重组P1蛋白和CDV发生反应;ELISA叠加试验增殖结果表明,两株单克隆抗体识别的抗原表位不同。本研究制备的特异性抗CDV-P1的单克隆抗体为建立CDV免疫学检测方法和P蛋白的功能研究奠定了基础。     

H5亚型AIV HA抗原表位重组蛋白McAbs的制备及应用

目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。