鸭呼肠孤病毒p18重组蛋白表达、纯化及其单克隆抗体制备

研究旨在制备DRV p18蛋白单克隆抗体。试验通过原核表达并纯化DRV p18重组蛋白,经BCA蛋白浓度测定后免疫BALB/c小鼠;通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,获得的p18单克隆抗体通过ELISA、IFA和Western blot试验进行鉴定,并将杂交瘤细胞腹腔注射小鼠获得单抗腹水,通过Western blot试验验证其特异性。结果显示：纯化的重组p18蛋白浓度为1.37 mg/mL,经过三轮亚克隆获得4株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3、2C4、4A2和4D4,亚型鉴定1E3和4D4重链为IgG1型、2C4重链为IgM型、4A2为IgG2b型,轻链均为κ型;4株单克隆抗体均能使感染DRV的BHK-21细胞发出特异性荧光,并在18 ku处存在特异性条带;4D4腹水ELISA效价为1∶409 600,Western blot效价达1∶102 400,IFA效价为1∶51 200;4D4与DRV反应,而不与其他禽源常见病毒反应。研究成功制备了抗DRV p18蛋白的单克隆抗体,为进一步研探究p18蛋白的功能奠定基础。     

抗鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

自2016年以来,鹅星状病毒(GoAstV)已成为当前危害鹅养殖业生产的重要病原体之一,雏鹅均易感,主要引起9~19日龄雏鹅死亡,以雏鹅腿关节肿胀及肾脏尿酸盐沉积导致肾炎为主要病征。建立相应的病原学与血清学检测方法对于防控该病至关重要。为建立基于病毒Cap蛋白的诊断技术,本研究构建了鹅星状病毒去核定位信号肽的Cap基因原核表达质粒pET-30a-Cap,转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western blot检测Cap蛋白的表达。大量表达并纯化重组蛋白后,将其免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测免疫小鼠抗体效价,制备单克隆抗体,并对其进行鉴定。结果显示:获得的重组蛋白分子量约为28 kDa;通过3次亚克隆筛选最终获得5株杂交瘤细胞株1A5G10、1C11B11、5B7G8、9A12B12、9C3E11,抗体效价均可达1:51~200以上;1A5G10、5B7G8、9C3E11重链为IgG1型,1C11B11、9A12B12重链为IgG2b型,轻链均为κ型;制备的单克隆抗体均可与重组蛋白反应或GoAstV发生反应;其中5B7G8株与GoAstV发生反应,1C11B11、9A12B12株与GoAstV发生反应。本研究结果为GoAstV诊断方法的建立以及GoAstV Cap蛋白功能的进一步研究奠定了坚实基础。     

σNS蛋白与宿主TRAM1因子互作对鸭呼肠孤病毒复制的影响

宿主因子TRAM1(translocation-associated membrane protein 1,TRAM1)是一种参与I型膜蛋白质分解的蛋白,通过升高含量来缓解内质网(ER)在应激时的压力。前期研究发现,鸭呼肠孤病毒(duck reovirus,DRV)感染原代鸭成纤维细胞后,TRAM1宿主因子变化异常。为确定宿主细胞TRAM1因子与DRV非结构蛋白σNS是否存在相互作用以及相互作用对DRV复制的影响,本实验首先表达σNS蛋白,通过GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)发现TRAM1蛋白与σNS蛋白在细胞外存在相互作用;通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)试验证实二者在细胞内存在相互作用。过表达TRAM1能够从转录水平抑制DRV σNS的表达,而抑制TRAM1提高σNS的转录水平。本研究为进一步分析σNS蛋白在DRV复制过程中的功能以及为σNS蛋白与宿主因子TRAM1互作对DRV复制的影响提供试验依据。