蓝舌病病毒单克隆抗体的研究 Ⅰ.杂交瘤细胞的建立

用小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与经篮舌病病毒免疫的BALB/C小鼠脾细胞进行融合,产生杂交瘤细胞。以免疫荧光(间接法)和ELISA(间接法)进行杂交瘤抗体分泌检测,用有限稀释法进行3次克隆,获得5株抗体分泌稳定、产量高的单克隆抗体杂交瘤细胞株。     

克伦特罗单克隆抗体的研制及初步鉴定

为制备克伦特罗(clenbuterol,CL)单克隆抗体,鉴定其特性,采用重氮化法合成克伦特罗-人血清白蛋白(CL-HSA)作为免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术建立杂交瘤细胞株,利用体内诱生法制备单克隆抗体,用间接ELISA和间接竞争ELISA分别测定抗体效价和特异性.将细胞反复冻存和传代,考察稳定性.获得细胞株C611...     

抗促乳素单克隆杂交瘤细胞株的建立及鉴定

制备抗促乳素(prolactin,PRL)的单克隆抗体。应用PRL纯品免疫BALB/c小鼠,被免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性克隆,将阳性克隆多次有限稀释得到抗PRL阳性单克隆细胞株,杂交瘤细胞上清分离法和诱生腹水法制备单克隆抗体,测其效价。共建立5株持续分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为AA5B1、AB6C8、BB3C1、CA6E4、CE2H6。杂交瘤细胞株冻存4个月后复苏培养,形态良好,生长旺盛。培养液上清及腹水效价的OD值略有升高,说明杂交瘤细胞株稳定。5株杂交瘤细胞染色体众数均为99～105,并可见到中部和亚中部着丝点的骨髓瘤细胞标志染色体,说明5株杂交瘤细胞确为SP2/0骨髓瘤细胞与被免疫小鼠的脾细胞融合而产生的。     

抗水牛伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原单克隆抗体的研制

用纯化的伊氏锥虫变异表面糖蛋白（variant surface glucoprotein, VSG）免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过3次克隆和间接ELISA方法筛选,获得3D7、5B9 2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养液上清效价和小鼠腹水效价,其中细胞培养上清效价分别为1∶6400和1∶12800,腹水效价分别为1∶105和1∶106。单抗的亚型鉴定结果表明,3D7、5B9分泌的抗体都为IgG1亚类κ链。     

鸡新城疫病毒(NDV-XX08)单克隆抗体的制备与鉴定

本研究采用鸡胚繁殖NDV-XX08,差速离心法纯化NDV,用纯化的病毒免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与NSO细胞进行融合,用间接ELISA和血凝抑制试验(HJ)进行筛选,挑选效价高的杂交瘤细胞进行克隆和亚克隆,建立阳性杂交瘤细胞株,最终得到一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,命名为4F12。采用体外细胞培养和体内诱生腹水的方法制备了其McAb。对获得的单克隆抗体采用ELISA,HI,Western-Blotting方法进行鉴定。杂交瘤细胞培养上清和腹水的ELISA效价分别为1:160和1:3.2×10~4。获得的单克隆抗体与NDV具有良好的特异性反应,与鸡胚阴性尿囊液、鸡正常组织、鸡[gG、鸡传染性囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感检测抗原均无交叉反应性。HI试验表明,制备的单抗没有血凝抑制活性。Western-Blotting证明获得的单抗与新城疫病毒蛋白有特异性反应。经连续传代20次,冻存、复苏3次,4F12杂交瘤细胞株仍能稳定分泌抗体。     

牛干扰素单克隆抗体的制备与初步鉴定

通过IPTG诱导的大肠埃希菌表达重组牛干扰素-γ融合蛋白(BovIFN-γ),利用GlutathioneSepharose 4 Fast Flow亲和层析柱进行融合蛋白的纯化,纯化后的融合蛋白BovIFN-γ作为抗原免疫Balb/c小鼠,经5次免疫后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,间接ELISA筛选,有限稀释法克隆亚克隆获得分泌BovIFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过ELISA方法对其抗体效价、特异性、亚类及稳定性进行鉴定。获得一株稳定分泌BovIFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株A12E9,细胞培养上清和腹水效价可达1∶3 200和1∶160 000。     

洛克沙胂完全抗原的制备及其单克隆抗体的研制

本研究以洛克沙胂(ROX)的结构类似物3-氨基-4-羟基苯胂酸(HAPA)为小分子半抗原,采用碳二亚胺法,分别将其与载体蛋白——牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原HAPA-BSA和检测抗原HAPA-OVA。经紫外光谱扫描及聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定后,以20μg/只剂量的HAPA-BSA免疫BALB/c小鼠;选择血清效价高、敏感性强的小鼠,取脾脏进行细胞融合,制备杂交瘤细胞株。利用间接ELISA法筛选得到1株可以稳定分泌抗ROX单克隆抗体的细胞株,命名为G12;间接ELISA法测定其细胞上清效价为1:512,间接竞争ELISA测定其半数抑制浓度IC_(50)为3.147 ng/μL。经小鼠体内诱生腹水,辛酸-硫酸铵法纯化获得纯度较高的单克隆抗体,间接ELISA测定其效价为1:102 400,IC_(50)为1.433 ng/μL,且具有良好的特异性。本试验成功合成了ROX人工抗原,并制备了可以分泌高敏感性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为ROX免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV) CH-IR株单克隆抗体的制备

用纯化的猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)免疫Balb/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,使脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA 筛选,4次有限稀释法克隆,得到1株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3D₆),经鉴定,该单抗为IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条,杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1∶512和1∶20480。这株单克隆抗体与伪狂犬病毒、猪丹毒、猪细小病毒均不发生交叉反应,显示出良好的特异性。连续培养20代后能稳定分泌抗体,此单克隆抗体的获得为PRRSV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

牛初乳免疫球蛋白IgG单克隆抗体的制备

为了制备牛初乳免疫球蛋白IgG单克隆抗体,试验利用标准IgG蛋白作为免疫原,免疫6周龄Balb/c雌性小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA法筛选,采用有限稀释法,经过3次克隆筛选,获得2株稳定分泌抗IgG蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为E7和D9,并进行了亚类鉴定.结果表明:该杂交瘤细胞培养上清液抗体效价抗体...     

磺胺氯吡嗪钠单克隆抗体的制备及鉴定

应用重氮化方法制备了磺胺氯吡嗪钠(sulfachloropyrazine sodium,SPZ)完全抗原SPZ-OVA,将成功偶联的人工全抗原(SPZ-OVA)免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,经间接ELISA检测,1号小鼠血清抗体效价达到1:6.4×104。取该小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。利用ELISA方法对融合后的杂交瘤细胞上清进行检测,筛选出能够稳定分泌抗体的细胞株:D9。将细胞株D9扩大培养后,经腹腔注射小鼠使其产生腹水。腹水单抗经纯化后,通过间接竞争ELISA对该单克隆抗体的效价、半数抑制浓度以及特异性进行检测。结果表明,所制备的单克隆抗体效价为1:4×105,半数抑制浓度为326 ng/m L,特异性良好。     

胃蛋白酶原Ⅱ单抗制备及夹心ELISA的初步建立

制备配对胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)单抗,建立人血清中胃蛋白酶原Ⅱ夹心ELISA检测方法。用胃蛋白酶原Ⅱ免疫Balb/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0融合,用HAT培养基进行筛选培养,间接ELISA检测阳性克隆,对阳性孔进行多次单克隆化,选出效价高、分泌性能稳定的杂交瘤细胞,制备腹水并进行纯化。进行单抗配对,建立胃蛋白酶原Ⅱ双抗体夹心检测方法。获得1D8、1C6、2H11、2E3等4株杂交瘤,经配对试验,确定1D8、2H11可作为夹心ELISA检测PGⅡ的单抗。成功制备出配对单抗,初步建立了PGⅡ双抗体夹心ELISA方法。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒（AEV）Van Roekel株作为免疫原，免疫6周龄BALB／c小鼠，采取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA法筛选，间接免疫荧光法（IFA）和免疫组织化学法鉴定，经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2，制备了腹水，并利用该单克隆抗体初步建立了Dot—ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。     

家蚕微孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)总蛋白为抗原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,第1次融合率为13.3%,第2次融合率为55.4%。建立间接酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体。初检阳性率分别为4.68%和5.26%。经3次亚克隆筛选获得了2株能稳定分泌抗家蚕微孢子虫的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G10和2B10。间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence test,IFAT)和Western-bloting分析证实所获得的单克隆抗体是特异针对家蚕微孢子虫蛋白的,将在孢子孢壁蛋白的研究中发挥重要作用。     

猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体的研制

利用猪繁殖与呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）国内分离株Ｊ１,采用反复差速离心法制备免疫抗原,长程免疫法免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,用间接ＥＬＩＳＡ方法检测抗体,通过细胞融合技术,并经３次亚克隆获得了１０株能稳定分泌抗ＰＲＲＳＶ单抗的杂交瘤细胞单克隆株（Ａ１Ｄ７Ｈ１０,Ａ１Ｄ７Ｈ１１,Ａ１Ｅ７Ｈ９,Ａ１Ｅ７Ｄ９,Ａ２Ｄ８Ｅ７,Ａ２Ｄ８Ｂ１１,Ｂ３Ｄ１１Ｄ６,Ｂ２Ｇ９Ａ９,Ｂ２Ｇ９Ｆ２）。这些细胞经体外连续传     

赤羽病毒单克隆抗体的研制及鉴定

用纯化的赤羽病毒（akabane virus,AKAV）免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌抗赤羽病毒单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株,分别命名为AKAV McAb 3A株和2C株。ELISA试验和中和试验结果表明,本研究制备的2株McAb均具有良好的特异性,为AKAV阳性,杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价分别为1∶640和1∶320,腹水的效价分别为1∶256000和1∶128000,亲和常数（Ka）分别为1.16×10^-9和6.31×10^-8 mol/L,3A株的相对亲和力大于2 C株,具有病毒中和活性,中和效价分别为1∶64和1∶32,其IgG亚类为IgG1,轻链的亚型均为kappa型,2株细胞冻存3次复苏后仍能稳定分泌抗体,表明AKAV McAb制备成功,为赤羽病快速诊断方法的研究奠定了基础。     

抗猪附红细胞体单克隆抗体的制备

以纯化的猪附红细胞体免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并用间接ELISA方法进行筛选,经过间接ELISA方法、免疫印迹和间接免疫荧光试验进行鉴定,共获得5株分泌抗猪附红细胞体单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1H1、1H2、3A5、5B1和7E11,其单抗亚类鉴定分别属于IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b和IgG2b。这5株McAb均能与猪附红细胞体全菌蛋白发生特异性反应,而不与猪肺炎支原体、猪链球菌、大肠杆菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒发生反应,并且1H1、3A5和5B1能识别同一抗原位点,1H2和7E11识别另一抗原位点。     

猪流行性腹泻病毒S2基因B细胞表位的筛选及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的 应用生物学软件与单克隆抗体技术相结合的方法鉴定PEDV S2基因B细胞表位肽。方法 利用CLC Sequence viewer 6.8软件及在线数据库IEDB筛选出PEDV S2基因B细胞表位,并人工合成表位肽。将表位肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）耦联后作为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,通过ELISA法筛选出抗体效价较高的小鼠进行1次加强免疫,3 d后取脾脏制备脾细胞悬液进行细胞融合。经HAT选择培养基培养筛选有效杂交瘤细胞,采用ELISA法筛选阳性克隆继续进行扩大培养。将部分阳性杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射,并收集腹水。通过ELISA方法分别检测小鼠腹水和单克隆细胞株培养上清液抗体效价,确定最高效价作为后备细胞株。结果 筛选出B细胞表位肽序列为:MQYVYTPTYYML;免疫多肽抗原后融合前血清抗体效价达到1:2 000;BALB/c小鼠腹水及单克隆细胞株培养物上清液ELISA检测结果显示抗体效价达到1:4 000。结论 筛选出了PEDV S2基因B细胞表位,为PEDV表位肽疫苗载体构建研究提供参考。     

三聚氰胺单克隆抗体的制备与鉴定

本实验利用三聚氰胺类似物与血蓝蛋白、卵清蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原,免疫Balb/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、筛选和克隆等,得到了抗三聚氰胺单克隆抗体。该抗体亚类为IgG1,制备的单克隆抗体腹水效果评价达10-7,与其他三聚氰胺结构类似物无交叉反应。三聚氰胺单克隆抗体的获得为进一步研发三聚氰胺药物残留检测试剂盒的研制奠定了基础。     

猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体的制备及鉴定

[目的] 纯化猪塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV）SVV-CH-HB2016毒株，并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体。[方法] 以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行细胞融合。通过间接免疫荧光试验（IFA）结合间接ELISA筛选阳性细胞株，制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株。采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白的反应性，并对单克隆抗体的病毒中和保护效果进行测定。利用空斑试验和实时荧光定量PCR方法探究中和性单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株吸附过程的影响，最后用抗体相加试验来分析14株单克隆抗体的抗原表位。[结果] 在蔗糖密度梯度为5%~45%（W/V）时获得了纯度较好、浓度较高的SVV-CH-HB2016毒株结构蛋白，免疫小鼠血清抗体效价均达到了1：12 800，成功制备了17株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经验证14株单克隆抗体能与重组结构蛋白发生Western blotting反应，17株单克隆抗体能与病毒发生IFA作用；2G6、4A3和4C11 3株单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株感染的BHK-21细胞具有明显中和保护作用，也能有效抑制SVV-CH-HB2016毒株对293T细胞的吸附。经分析发现，除1F5与2E1、4B8与4F11外，其余10株单克隆抗体分别针对不同抗原表位。[结论] 本研究初步建立了SVV的纯化方法，制备了17株特异性针对SVV-CH-HB2016毒株的单克隆抗体，为后期进一步开展SVV全病毒灭活疫苗的研发、ELISA检测方法的建立及保护性抗原表位的鉴定奠定了基础。     

1株抗欧洲型和美洲型PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用RT-PCR方法扩增出欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SS-6毒株的核衣壳(N)蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建了重组表达质粒pGEX-N,并将其转化到大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的诱导下获得高效表达,重组蛋白的分子量约为40 ku。用纯化的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体。经细胞融合获得一株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,命名为1 B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgG1型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:640,腹水的效价为1:256 000,为猪繁殖与呼吸综合征的诊断奠定了基础。