抗双氯青霉素单克隆抗体的制备与初步鉴定

采用碳化二亚胺法,将双氯青霉素(dicloxacillin)与牛血清白蛋白偶联制备免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆,获得1株可稳定分泌McAb的杂交瘤细胞5D4-C9-C8;间接ELISA方法测定,其细胞上清抗体效价为1∶300,腹水效价为1∶3.5×105,为IgG1,与其结构类似物邻氯青霉素、苯唑青霉素的交叉反应率分别为17.6%和26.1%,与苄青霉素、羟氨苄青霉素和氨苄青霉素均无交叉反应性。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。为进一步研制检测双氯青霉素的ELISA试剂盒奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性分析

分别用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb)。用纯化的PRRSV免疫小鼠,经细胞融合获得2株可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4B8、4D8。用重组N蛋白免疫的小鼠,经细胞融合获得3株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞2F3、4D5、5D11。间接ELISA检测4D8、4B8、4D5和5D11杂交瘤上清效价为1∶32~1∶512,而2F3的腹水效价为1∶12 800。单抗2F3、4B8和4D8与纯化病毒的Western blotting反应都为阳性,而4D5和5D11为阴性。IFA检测结果5株单抗都有明显的荧光,与PRRSV呈阳性反应。2F3的Ig亚型为IgM。5株单抗杂交瘤细胞连续传代至20代,分泌相应McAb的效价基本一致。本研究为PRRSV生物学诊断和方法研究提供有用工具。     

抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本试验旨在为PCV2的快速诊断提供技术手段。用纯化的原核表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(pET-Cap)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了2株能够稳定分泌抗pET-Cap抗体的杂交瘤细胞株3D5和5C5。经建立的间接ELISA试验检测3D5、5C5细胞上清效价分别为1∶2048、1∶1024;诱生腹水的效价分别为 1∶204800、1∶102400,杂交瘤染色体数目分别为95条、96条。Western blotting结果表明,2株单抗能与病毒发生特异性反应。传代培养20代,3个月内复苏冻存3次,3D5、5C5能够稳定分泌抗体。     

副猪嗜血杆菌OMP5单克隆抗体的制备与鉴定

用副猪嗜血杆菌（HPS）血清5型灭活菌液免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以HPS外膜蛋白5（OMP5）为抗原,经间接ELISA法筛选阳性融合孔,并用有限稀释法对筛选的阳性孔进行亚克隆,获得2株分泌抗HPS OMP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E2和8D9;间接ELISA法效价检测,1E2和8D9细胞培养上清抗体效价均为1∶2 560,纯化后腹水抗体效价分别为1∶204 800和1∶51 200;抗体型别鉴定,1E2和8D9分别分泌IgG2b、IgG2a型抗体;特异性检测表明,2株单抗均能特异识别OMP5。将2株杂交瘤细胞反复冻融3次复苏后仍能稳定分泌抗体。2株抗HPS OMP5单克隆抗体的成功制备,将为HPS感染快速检测方法的建立以及检测试剂的研制奠定基础。     

抗猪繁殖与呼吸系统综合征病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备

为了研究制备抗猪繁殖和呼吸系统综合征病毒重组核衣壳蛋白(N蛋白)单克隆抗体,试验用N蛋白免疫Balb/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选等技术制备单克隆抗体。结果表明:所制备的单克隆抗体3B5为IgG2a亚类,杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1∶800和1∶32 000,连续培养20代后能稳定分泌抗体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株膜基质蛋白单克隆抗体的研制

为制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株单克隆抗体,用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株免疫BALB/c小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇作用下融合,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光试验（IFA）筛选,以有限稀释法克隆3次,制备单克隆抗体,并对制备的单克隆抗体进行鉴定。结果表明获得了2株分泌PRRSV膜基质蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1D12、5H5,经鉴定其抗体亚型分别为IgG2b、IgM,2株均为κ链,腹水ELISA效价分别为1∶107和1∶105。该单克隆抗体与PRV、PPV、PCV、CSFV、JEV无交叉反应。作者成功制备了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株膜基质蛋白单克隆抗体,为进一步建立相关诊断方法奠定了基础。     

牛初乳免疫球蛋白IgG单克隆抗体的制备

为了制备牛初乳免疫球蛋白IgG单克隆抗体,试验利用标准IgG蛋白作为免疫原,免疫6周龄Balb/c雌性小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA法筛选,采用有限稀释法,经过3次克隆筛选,获得2株稳定分泌抗IgG蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为E7和D9,并进行了亚类鉴定。结果表明:该杂交瘤细胞培养上清液抗体效价抗体效价E7为1∶3.01×103,D9为1∶5.24×104;腹水抗体效价E7为1∶2.52×105,D9为1∶7.01×106;E7和D9分泌的单克隆抗体均为IgG1型,轻链为λ链抗体。     

马绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

本研究采用马绒毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin,eCG)纯品免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1∶10融合,间接酶联免疫吸附法(ELISA)筛选阳性克隆和有限稀释法克隆,扩大培养后于小鼠腹腔制备腹水,共得到8株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用间接ELISA测定抗体效价,效价均达10^-5以上。用获得的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体,为eCG分泌水平的ELISA检测方法的建立确立了条件。     

抗鸡IgM(μ链)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

以绵羊红血球免疫鸡,获得富含IgM的鸡血清。以提纯鸡血清IgM免疫BALB/C小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法进行筛选,共获得7株稳定分泌特异性抗鸡IgM杂交瘤细胞)TM18、TM21、TM25、TM34、TM57、TM62、TM65)。杂交瘤培养上清的ELISA效价为10~3～10~5,腹水型单克隆抗体的ELISA效价为10~5～10~7。7株单抗中TM57、TM65为小鼠IgM类,其余5株均为小鼠IgG_1亚类。间接ELISA和夹心ELISA试验表明,所有7株单抗只与鸡IgM反应,而不与鸡IgG和鸡IgA反应。7株单抗均能抑制鸡IgM对其特异抗原绵羊红血球的血凝作用。血凝抑制价为1∶2~3～2~7,7株单抗中只有TM65能在琼脂扩散试验中与鸡IgM出现沉淀线.     

分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

为制备犬细小病毒(CPV)单克隆抗体,用F81细胞繁殖CPV,病毒液经二乙烯亚胺(BEI)灭活、纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经筛选获得2株分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为F1和B6.F1和B6分泌的单克隆抗体Ig亚类均为IgG1;以F1和B6制备的腹水,经检测,间接ELISA效价均为1×105,免疫荧光效价分别为1:3200和1∶6400;F1和B6培养上清的抗体中和效价分别为1∶1024和1∶2048,血凝抑制效价分别为1∶2048和1∶4096;免疫印迹(Western-blotting)和抗原表位分析结果显示,F1和B6分泌的单克隆抗体可能分别针对CPV的空间表位和线性表位.2株分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立可进一步用于开发CPV特异性诊断制剂和治疗制剂.     

吉氏巴贝斯虫单克隆抗体制备的研究

应用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞株 ,经间接萤光抗体法筛选和克隆 ,获得了 5株能稳定分泌吉氏巴贝斯虫特异性抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为C3B5、M8B7、E9C5、G6 D8、H2 A7。经过鉴定 ,这 5株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类及相对分子质量分别为IgG2b,1 8× 1 0 4 ;IgG2a,1 8× 1 0 4 ;IgG1 ,1 8× 1 0 4 ;IgM ,3 2× 1 0 4 ;IgM ,1 8× 1 0 4 。腹水效价为 1∶1 0 4 ～ 1∶1 0 5。其中E9C5杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体是一种保护性抗体 ,经对实验感染吉氏巴贝斯虫小鼠体内虫体的杀虫试验证明具有较强的杀灭作用。     

单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性研究及单克隆抗体的制备

原核表达单增李斯特菌(Lm)ActA蛋白并进行亲合层析纯化,检测ActA的免疫原性,以表达蛋白为检测抗原制备Lm单克隆抗体,并对单抗的亚型、效价、亲合力及特异性进行测定。结果表明,成功表达了ActA蛋白;表达蛋白诱导了特异性的细胞免疫和体液免疫,具有良好的免疫原性;共获得4株抗Lm ActA单克隆抗体。其中3G6、4E10和2B9为IgG1亚类;腹水抗体效价,3G6和4E10为1∶64000,2B9为1∶32000;3G6、4E10和2B9的亲和常数分别为6.62×107M-1、5.67×107M-1和7.15×106M-1;3G6、2B4和4E10为Lm特异性单抗,2B9为致病性李斯特菌特异性单抗。所制备的单抗可用于Lm检测方法的建立。     

盐碱胁迫冬油菜的主导因素分析

用4种盐分为A因素（NaCl、Na2SO4、Na2CO3和NaHCO3的依次盐分组成摩尔比为A1（1∶9∶9∶1）、A2（1∶1∶1∶1）、A3（9∶1∶1∶9）和A4（1∶1∶9∶9）与5种盐浓度为B因素（盐浓度B1、B2、B3、B4和B5 分别为10、20、30、40和50 mmol·L-1）的双因素试验,模拟20种不同盐度和pH的盐碱条件处理冬油菜“陇油6号”（Brassica campestris cv.Longyou No.6）的种子和幼苗7 d后,测定其种子发芽率、幼苗叶片细胞膜透性、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白含量和根系活力等指标。结果表明,随着处理盐浓度的增加,种子发芽率、幼苗根系活力和可溶性蛋白含量降低,叶片细胞膜透性和脯氨酸的含量增加;降低和增加程度由A1～A4大体增强,不同盐组成处理间差异显著（P＜0.05）。用盐度(Na+)、pH值、CO32-和Cl-代表盐碱混合条件所有胁迫因素,胁迫因素与胁变指标间均具有高度线性相关性。pH值、盐度(Na+)和CO32-是盐碱混合条件对冬油菜胁迫的主导因素,而Cl-的胁迫作用也不可忽略。     

稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体细胞株的筛选与应用

研制抗羊种布鲁菌脂多糖抗原的单克隆抗体,并应用其建立检测布病的双夹心ELISA方法。本研究采用热酚水法提纯羊种布鲁菌(16M菌株)的脂多糖抗原,并经SDS-PAGE鉴定。用脂多糖和灭活的羊种布鲁菌16M作为免疫抗原,交替免疫6～8周龄BALB/c雌鼠,第1次免疫用羊种布鲁菌标准菌16M全菌加等量弗氏完全佐剂;第2次免疫用脂多糖加等量弗氏不完全佐剂。将脂多糖作为包被抗原建立间接ELISA方法,筛选针对抗羊种布鲁菌(16M菌株)脂多糖的单克隆抗体杂交瘤细胞株。筛选出3株能稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5H3、6B8和3H7,细胞培养上清的ELISA效价在1∶1 000～1∶5 000,小鼠腹水单克隆抗体ELISA效价在1∶10 000～1∶160 000;抗体亚类鉴定表明:5H3、6B8属于IgM亚类,3H7属于IgG3亚类;特异性试验结果显示:3株杂交瘤细胞分泌的抗体不与大肠杆菌O157裂解抗原、鸡白痢沙门氏菌裂解抗原、鸭源鸡杆菌脂多糖抗原以及福氏志贺菌裂解抗原反应,仅与灭活的羊种布鲁菌(16M)发生反应。布鲁菌虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测结果显示,获得的单抗可与标准检测抗原形成明显的颗粒凝集物和伞状凝集物。利用所建立的单克隆抗体细胞株,建立了一种检测布鲁菌的双夹心间接ELISA方法,并进行了特异性和敏感性检测。对模拟样品和临床样品进行检测,准确性均很高。     

牛支原体HB0801株VspX蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）VspX蛋白单克隆抗体,将编码该蛋白的基因克隆、表达并纯化,作为免疫原,以QuickAntibody-Mouse 5W为免疫佐剂,免疫BALB/c小鼠。经3次免疫后,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经3次亚克隆筛选后,共获得5株能稳定分泌抗VspX蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A8、3A3、3C12、3H9及4D11。亚型鉴定表明,3C12重链为IgG2b,其余4株为IgG1,轻链均为κ链。间接ELISA结果表明,5株细胞培养上清的抗体效价在1：1×10⁴~1：2×10⁵,腹水效价在1：1×10⁵~1：8×10⁵。选其中两株杂交瘤细胞株3H9和4D11的腹水纯化,进行亲和力测定,解离常数分别为6.3×10⁹和7.8×10⁹,属高亲和力抗体。Western blotting结果显示,5株单抗均能与牛支原体发生特异性反应,而单抗4D11与羊无乳支原体标准株PG2和丝状支原体丝状亚种标准株PG3均不反应。流式细胞术结果表明,单抗4D11与牛支原体表面的VspX的结合呈剂量依赖性。间接免疫荧光结果表明,单抗4D11可以识别黏附到胚胎牛肺细胞上的重组VspX蛋白。本试验成功制备的单克隆抗体为VspX蛋白功能的研究奠定基础。     

Preparation and Identification of the Monoclonal Antibodies against VspX Protein in Mycoplasma bovis strain HB0801

To obtain the monoclonal antibody (McAb) against VspX protein of Mycoplasma bovis (M. bovis),VspX gene was amplified, expressed and purified. Then, BALB/c mice were immunized subcutaneously three times with the purified recombinant VspX (rVspX) mixed with QuickAntibody-Mouse 5W adjuvant. Three days after the last injection, spleen cells were collected aseptically, and fused with SP2/0 myeloma cells in the presence of polyethylene glycol. By the clone selection, five stable hybridomas against VspX protein were obtained, separately named as 1A8, 3A3, 3C12, 3H9 and 4D11. Antibody titers in cell supernatant were from 1:1×10⁴ to 1:2×10⁵, while from 1:1×10⁵ to 1:8×10⁵ in ascites of mice by indirect ELISA. The subtypes were determined to be IgG1 and IgG2b class, and all light chains were κ chain. The affinity constant of McAb 3H9 and 4D11 were 6.3×10⁹ and 7.8×10⁹, respectively, and they belonged to high-affinity antibodies. Western blotting results showed that all of five McAbs could specifically react with M.bovis, however, McAb 4D11 could not react with Mycoplasma arginini PG2 and Mycoplasma mycoides subsp. PG3. Flow cytometry showed that McAb 4D11 reacted with surface VspX of M. bovis in a dose-dependent manner. Indirect immunofluorescence assay demonstrated that 4D11 McAb was able to detect rVspX protein binding to embryonic bovine lung cells. In the present study, McAbs against rVspX protein had been successfully prepared, which provided a basis for future researches about the function of VspX protein and the pathogenesis of M. bovis.