鸭肝炎病毒GD株的全基因组序列测定与分析

为了给在分子水平上研究鸭肝炎病毒(DHV)的致病机理奠定基础,进一步丰富DHV的遗传变异和进化信息,试验采用RT-PCR方法分段克隆获得DHV-1 GD株的全基因组序列并进行序列分析。结果表明:GD株的基因组全长7 690 nt[不含Poly(A)尾],5’端和3’端非编码区长度分别为626 nt和314 nt,单一开放阅读框架(ORF)为627～7 376 nt,编码2 249个氨基酸;GD株与DHV-1参考株比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.8%～99.7%和97.7%～99.6%;与中国台湾和韩国新型DHV(DHV-N)相比同源性分别为72.7%～73.2%和81.8%～83.4%;GD株与DHV-1参考株遗传进化关系较密切,处于同一分支,而与DHV-N遗传关系较远,处于不同分支。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离与鉴定

利用I型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组的5′端UTR附近区域设计1对引物,以病死鸭肝组织悬液、鸭胚尿囊液毒和鸡胚尿囊液毒为模板,RT-PCR扩增得到336 bp基因片段。经测序分析病死鸭分离病毒与已发表鸭病毒性肝炎DHV-Ⅰ型病毒的基因同源性可达98%,该病毒与已知DHV-Ⅰ毒株之间病毒基因组一级结构有较高的同源性。为进一步验证所分离的病毒为Ⅰ型鸭肝炎病毒,依据Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因特异性引物进行PCR,得到714 bp左右目的片段,证明该病毒为鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒。     

鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒(DHV)浙江分离株Z10的全基因(5',3'末端序列用RACE法扩增)及4株DHV分离株的VP1基因.结果表明,分离株Z10的全基因片段长7689 bp,有1个大的开放读码框(ORF),ORF位于626～7326位核苷酸,编码2249个氨基酸.Z10分离株全基因序列与GenBank登录的6株具有代表性的DHV核苷酸序列比对,同源性94.5%～98.4%;所测得的DHV分离株的VP1基因的序列与目前GenBank上发表的具有代表性的DHv-Ⅰ VP1基因进行比对分析,结果4株Ⅰ型DHV的VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸.4株DHV-Ⅰ之间VP1基因的核苷酸序列同源性为93%～99.7%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;与参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为92.2%～100%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,属于同一基因群.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒A66弱毒株全基因组分子克隆及序列分析

采用RT-PCR法对Ⅰ型DHV A66弱毒株基因组全序列进行了分子克隆与测序.研究结果表明,不含Poly(A)尾巴的A66株的基因组全长为7 704个核苷酸残基,包括626个核苷酸残基的5′端非编码区、6 750个核苷酸残基的开放阅读框和314个核苷酸残基的3′非编码区.应用分子生物学软件将A66株与GenBank公布的其他DHV-Ⅰ全基因序列进行同源性比较分析,结果表明,除了90D和04G两株变异株外,A66株ORF的核苷酸序列与其他各株的同源性在94.3%～99.7%之间,氨基酸序列的同源性在97.3%～99.6%之间,并且A66与C80、JX弱毒株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高,在99.4%以上,各毒株氨基酸序列同源性比核苷酸同源性略高.Ⅰ型DHV病毒基因组的一级结构高度保守.     

鸭肝炎病毒基因的生物信息学分析及多聚蛋白的加工预测

对NCBI GenBank中登录的鸭肝炎病毒1型(DHV-1)全基因组及VP1基因进行生物信息学分析,27株DHV-1全基因组序列其核苷酸同源性分别为93.3%～99.8%、多聚蛋白氨基酸序列同源性则达97%～99.8%,DHV-1和其他小RNA科病毒的多聚蛋白的氨基酸序列同源性均低于30%,多聚蛋白氨基酸序列进化分析显示DHV-1在小RNA科病毒上形成一个独立的进化分支.因此,应在小RNA病毒科中设立一个DHV-1的新病毒属.分析发现,在DHV-1 VP1区存在多个免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点及其抗原决定簇.在DHV-1多聚蛋白的第1 757 aa～1 761 aa位,出现3 C蛋白酶(3 Cpro)的共有基序Gly-Ser-Cys-Gly-Gly,同时发现在751 aa/752 aa处存在自我切割基序NPG ↓ P.推测在整个DHV-1多聚蛋白的切割过程中首先进行NPG ↓ P切割,形成P1,P2-P3前体蛋白,进而再由3 Cpro对2个前体蛋白进行二级加工,最终DHV-1多聚蛋白总共被切割成12个成熟产物,形成其结构蛋白与非结构蛋白.     

2020—2021年山东省部分地区鸭圆环病毒全基因组遗传进化及特征分析

为了解山东地区鸭圆环病毒(DuCV)流行状况及基因组特征,对山东济宁、潍坊等地区的病鸭病料进行DuCV检测及鉴定,DuCV阳性样品进行全基因组扩增,并进行遗传进化和基因组特征分析。结果显示:成功获得了14株DuCV的全基因组序列,全长为1 993～1 995 bp,遗传进化显示这些毒株与德国株AY22855处同一进化分支,均属于DuCV基因Ⅰ型,但不同年份之间已形成独立小分支且彼此之间同源性不高;Cap和ORF3蛋白氨基酸序列分析发现,2020年与2021年监测毒株Cap蛋白氨基酸同源性为96.7%,提示病毒变异速度和程度较高,增加了防控的难度。研究为山东地区鸭圆环病毒病的防控提供了重要数据支撑。     

新型鸭肝炎病毒全基因组序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(DHV)基因组变异情况,本研究将广东地区分离到的1株,山东地区分离到的2株与1型DHV(DHV-1)无抗原交叉性的新型DHV(N-DHV)全基因组序列测定的结果进行了分析。结果表明,N-DHV基因组全长7786nt～7788nt,仅有一个ORF,其结构具有典型的微RNA病毒科病毒基因组特征。ORF编码一个2251aa的聚合蛋白,该蛋白经3Cpro切割产生3个结构蛋白(VP0、VP3、VP1)和8个非结构蛋白(2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D)。与其他N-DHV毒株及DHV-1的抗原性相关VP1蛋白氨基酸序列比对表明,3株病毒之间及与国内分离的N-DHVG株的同源性均在98%以上,与韩国N-DHV同源性均大于92%,与中国台湾地区N-DHV同源性为80.1%～80.9%,与DHV-1的同源性为76.9%～77.3%。3株病毒与韩国N-DHVVP1氨基酸差异位点主要集中在C-端的高变异区。依据微RNA病毒科人肠病毒属血清型分型标准,GD株、SD01株、SD02株与韩国N-DHV和G株属于同一血清型,而与DHV-1和中国台湾地区新型DHV属于不同的血清型。     

一株Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因组序列分析

为了研究Ⅰ型鸭肝炎病毒( DHV -Ⅰ)遗传变异情况,试验采用全基因组序列测定的方法对广东省佛山地区分离到的1株Ⅰ型鸭肝炎病毒进行分析研究.结果表明:不含poly(A)尾的DHV -Ⅰ基因组全长7 690 bp,只含有1个开放阅读框(ORF),编码2 249个氨基酸;将此病毒株与GenBank公布的其他DHV全基因序列...     

鸭肝炎病毒Ⅰ型分离株JL11全基因序列测定与分析

本文旨在对分离得到的Ⅰ型鸭肝炎病毒毒株进行研究,通过PCR方法扩增目的基因,得到全基因序列。通过对全基因组的同源性比较和绘制进化树分析,结果表明该基因组与其他Ⅰ型鸭肝炎病毒毒株同源性在95%~99%,且亲缘关系较近。     

鸭新城疫病毒分离株抗原表位和遗传演化分析

从规模化养殖场鸭群气管和泄殖腔试子分离到新城疫病毒(NDV)27株,用2株针对NDV HN单抗进行抗原表位分析,并选择4个分离株进行F基因高变区(374bp)和HN基因全长序列分析。抗原表位分析结果显示,27个鸭分离株均能与其中一株单抗C3-B7反应,而与另外一株单抗1E5反应为阴性。F基因(374bp)序列分析结果显示,4个鸭分离株均属于NDV ClassⅠ分支,分离株之间核苷酸同源性为99.2%～100%;分离株与NDV ClassⅡ毒株遗传距离为0.9%～9.9%,与NDV ClassⅠ毒株遗传距离为38.5%～41.7%。根据核苷酸序列推导的氨基酸序列表明,4个鸭NDV分离株F蛋白裂解位点氨基酸模式为:112-EROERL-117。HN基因序列分析结果显示,4个鸭NDV分离株HN基因全长1851bp,编码585个氨基酸;同源性比较发现4个鸭NDV分离株之间核苷酸同源性为99.7%～99.8%,与NDV ClassⅡ毒株核苷酸同源性为68.4%～70.5%,与NDV ClassⅠ毒株核苷酸同源性为95.8%～98.0%。本研究结果显示,鸭分离毒均属于NDV ClassⅠ弱毒,在抗原表位和基因序列上与广泛应用的NDV弱毒疫苗株(LaSota)不同,这些毒株的来源有待进一步深入研究。     

鸭肝炎病毒地方株VP1基因的序列测定及分析

从湖北某发病鸭场分离到一株鸭肝炎病毒DHV/HB98,通过RT-PCR方法扩增该毒株的VPI基因的核苷酸序列.系统发育分析表明,DHV/HB98株的基因组序列与已发表的DHV-1 E53和ZJ的结构基因VP1亲缘关系最近,核苷酸的同源性为98.6％和98.3％,氨基酸序列的同源性为98.3％和98.7％,分析DHV/HB98与发表的变异株90D和04G核苷酸同源性为65.4％和66.7％,氨基酸同源性为69.5％和74.8％.推断该毒株属于DHV-1,与变异株是不同的血清型;DHV/HB98与DHV-1 ZJ具有相近的遗传关系,推断DHV/HB98也为强毒株.     

鸭肝炎病毒GD-B株生物学特性测定及多聚蛋白基因序列分析

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-I)基因组序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法分段扩增鸭肝炎病毒GD-B株多聚蛋白基因并克隆测序,构建多聚蛋白核苷酸系统进化树,并测定GD-B株部分生物学特性.结果表明,GD-B株多聚蛋白基因核苷酸序列与DHV-Ⅰ型GFS99广东株同源性最高(99.5％),属Ⅰ型鸭肝炎病毒,其EID50...     

Ⅰ型鸭肝炎病毒RNA聚合酶基因的克隆及原核表达

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV-Ⅰ）ZJ-Ⅴ株基因组序列（GenBank登录号：EF382778）,设计了一对扩增RNA聚合酶基因（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）的特异性引物,以ZJ-Ⅴ株基因组为模板,扩增DHV-Ⅰ的RdRp基因。运用DNAStar软件对ZJ-Ⅴ株病毒与GenBank上已发表的其他不同DHV毒株的RdRp基因序列进行同源性比较和遗传进化分析,结果表明,ZJ-Ⅴ株与A型DHV-ⅠR85952株（DQ226541）的同源性为97.1%,亲缘关系最近,与2株台湾新型（B型）DHV之间为76.9%和77.0%,与C-GY株和4株韩国新型（C型）DHV株之间为76.2%~76.5%,亲缘关系较远。将RdRp基因克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,获得重组表达质粒pET-RdRp,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示RdRp蛋白分子量约为65 kDa,Western blot检测证明RdRp蛋白能与Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清产生特异性免疫反应,具有良好的免疫学活性。本文为进一步研究DHV-Ⅰ的复制机理奠定了基础。     

2019年我国部分地区鸭圆环病毒基因序列测定与分析研究

为了解近年鸭圆环病毒流行毒株的基因遗传特点和变异情况,通过采用PCR的方法对我国部分地区的30份鸭圆环病毒阳性样品进行全基因组扩增与克隆、序列测定及遗传进化分析。结果显示:30株DuCV流行毒株之间的全基因序列同源性为85.8%~99.9%,其中26株DuCV的全基因序列长为1993~1995 bp,与德国代表株处于同一进化分支,属于基因1型,4株DuCV的全基因序列仅有1988 bp,与中国台湾代表株属于同一进化分支,属于基因2型;Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列的变异分析表明Cap蛋白的变异程度要显著高于Rep蛋白。     

鸭肝炎病毒的分离与鉴定

1999-2008年从山东、河南、浙江、江苏、广西、山西、江西、广东、福建和辽宁等地有典型鸭病毒性肝炎症状的病死雏鸭中共分离得到22株病毒。用鸭肝炎病毒（DHV）Ⅰ型（DHV-1）抗血清和新型DHV （N-DHV）抗血清对分离的22株病毒进行血清中和试验;对22株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,然后对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列进行分析。结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种血清型。其中分离到的12株为DHV-1,10株为N-DHV。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。12株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,10株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%-77%。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。     

鸭肝炎病毒分子流行病学分析

为了解我国鸭病毒性肝炎(DH)的流行情况,本研究用标准DH病毒(DHV)Ⅰ型(DHV-1)抗血清和新型DHV(N-DHV)抗血清对国内分离的7株DHV进行了血清中和试验。结果表明,PLK株和YB3株为DHV-1;YB1、YB2、YB5、HY2和HY3株为N-DHV。同时,对国内分离的9株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列分析的结果表明,3株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,6株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%～77%。参照同属微RNA病毒的人肠病毒的血清型分型标准,通过对DHV VP1基因序列同源性比较,判定9株病毒的血清型。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。同型不同毒株间VP1基因的差异可以导致病毒在致病力、细胞感染能力等方面的差异。研究结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种独立的血清型,但尚未见血清亚型的流行。     

新型鸭肝炎病毒GT株的全基因组序列分析

从河北省某鸭场发病鸭中分离到一株Ⅲ型鸭肝炎病毒(DHV)GT株,采用组织切片、全基因组测序和动物回归试验对其进行鉴定。结果显示:该毒株接种1日龄雏鸭,能引起显著的临床症状和肝细胞病变,该毒株的LD50为105.2;全基因组测序显示:该毒株全长7 802 bp,含652 bp的5′非编码区和366 bp的3′非编码区,编码2 516个氨基酸的多聚蛋白。根据Blast比对发现,该毒株属于DHV-C,与中国分离毒株C-YCW(98.1%)的同源性最高;从进化关系来看,与韩国型毒株的亲缘关系最近。表明该毒株属于我国流行的新型鸭肝炎病毒,命名为DHV-HBGT株。     

新型鸭肝炎病毒分离株JFX08全基因组测定与分析

对我国鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)分离株JFX08的全基因组进行了序列测定与分析。结果表明,JFX08毒株的基因组全长为7793nt,包括652nt的5’UTR,6753nt的ORF,366nt的3’UTR以及19nt的poly(A)尾巴。JFX08毒株的ORF编码2251个氨基酸,各基因均与韩国新型毒株的氨基酸序列相似性最高,与1型DHV和台湾新型DHV的序列相似性均较低。其中VP1较1型DHV存在2个氨基酸的插入和较多氨基酸位点的突变,高变区主要集中在180～194位和213～219位。JFX08毒株的非编码区核苷酸序列之间存在大量碱基突变和插入/缺失。多聚蛋白、VP0、VP3、VP1、2C和3D基因进化分析结果均表明,JFX08分离株与韩国新型DHV的遗传距离最近,属基因C型。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒分离株S1基因的序列分析

对鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)肾型毒株BJQ、BJS、BJY、SDW和HBN的S1全基因进行了扩增、克隆和序列测定,并将所分离毒株的S1基因序列与5个参考毒株进行了比较.结果表明,IBV分离株S1基因间核苷酸同源性在76.7%～92.1%之间,氨基酸同源性在73.9%～89.5%之间.氨基酸序列特征分析表明,S1基因多处存在突变、缺失和插入现象,其中在氨基酸69～81和142～150位点区出现较高的变异.系统进化树分析表明,除SDW株与Gray属于相同的进化分支外,其他国内肾型分离株属于同一个进化分支,而韩国、日本等亚洲分离株和美洲分离株分别属于其他不同的进化分支,说明IBV病毒的发生和流行与地域及所致病型有一定的相关性.     

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(N-DHV)的变异情况,本实验从广西、河南、山东临床发病鸭体内分离到3株病毒.通过RT-PCR检测为N-DHV.将分离株进行鸭胚传代培养,并测定鸭胚毒的ELD50为10-3.29/0.2 mL～10-465/0.2 mL.以1型和N-DHV阳性血清分别与分离株进行血清交叉中和试验,结果表明,Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)阳性血清对分离株无保护性.动物回归试验表明,分离株致死雏鸭的临床症状和病变与DHV-1相同,分离株的致死率为30％～70％.将分离株接种鸡胚,不产生任何病变,在鸡胚成纤维细胞中连续传5代后,细胞产生明显、规律的病变.扩增3株分离株的VP1基因,并进行氨基酸序列比对,结果表明3个分离株与DHV-C的同源性最高,与DHV-A的同源性最低,并存在氨基酸的插入和缺失.本实验表明3个分离株与韩国N-DHV属于同一血清型.