鸭肝炎病毒的分离与鉴定

1999-2008年从山东、河南、浙江、江苏、广西、山西、江西、广东、福建和辽宁等地有典型鸭病毒性肝炎症状的病死雏鸭中共分离得到22株病毒。用鸭肝炎病毒（DHV）Ⅰ型（DHV-1）抗血清和新型DHV （N-DHV）抗血清对分离的22株病毒进行血清中和试验;对22株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,然后对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列进行分析。结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种血清型。其中分离到的12株为DHV-1,10株为N-DHV。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。12株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,10株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%-77%。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。     

新型鸭肝炎病毒全基因组序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(DHV)基因组变异情况,本研究将广东地区分离到的1株,山东地区分离到的2株与1型DHV(DHV-1)无抗原交叉性的新型DHV(N-DHV)全基因组序列测定的结果进行了分析。结果表明,N-DHV基因组全长7786nt～7788nt,仅有一个ORF,其结构具有典型的微RNA病毒科病毒基因组特征。ORF编码一个2251aa的聚合蛋白,该蛋白经3Cpro切割产生3个结构蛋白(VP0、VP3、VP1)和8个非结构蛋白(2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D)。与其他N-DHV毒株及DHV-1的抗原性相关VP1蛋白氨基酸序列比对表明,3株病毒之间及与国内分离的N-DHVG株的同源性均在98%以上,与韩国N-DHV同源性均大于92%,与中国台湾地区N-DHV同源性为80.1%～80.9%,与DHV-1的同源性为76.9%～77.3%。3株病毒与韩国N-DHVVP1氨基酸差异位点主要集中在C-端的高变异区。依据微RNA病毒科人肠病毒属血清型分型标准,GD株、SD01株、SD02株与韩国N-DHV和G株属于同一血清型,而与DHV-1和中国台湾地区新型DHV属于不同的血清型。     

鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒(DHV)浙江分离株Z10的全基因(5',3'末端序列用RACE法扩增)及4株DHV分离株的VP1基因.结果表明,分离株Z10的全基因片段长7689 bp,有1个大的开放读码框(ORF),ORF位于626～7326位核苷酸,编码2249个氨基酸.Z10分离株全基因序列与GenBank登录的6株具有代表性的DHV核苷酸序列比对,同源性94.5%～98.4%;所测得的DHV分离株的VP1基因的序列与目前GenBank上发表的具有代表性的DHv-Ⅰ VP1基因进行比对分析,结果4株Ⅰ型DHV的VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸.4株DHV-Ⅰ之间VP1基因的核苷酸序列同源性为93%～99.7%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;与参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为92.2%～100%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,属于同一基因群.     

3株鸭肝炎病毒Ⅰ型结构基因VP1的克隆及序列分析

通过RT-PCR方法扩增鸭肝炎病毒DHV-1:161/79/V、YH、HN株的VP1基因的核苷酸序列.系统发育分析表明,3株病毒与已发表的DHV-1结构基因VP1核苷酸和氨基酸的同源性分别为92.7%～96.9%和95.4%～96.6%,与DHV-1变异株核苷酸和氨基酸序列的相似性均分别低于75%和88%,表明3株病毒属于DHV-1,与变异株是不同的血清型.强毒DHV-1:161/79/V的VP1蛋白第49和第183位氨基酸为T和H,弱毒DHV-1:YH、HN为S和Q,推测这2处位点的改变可能与病毒的强弱有关;DHV-1和其变异株的VP1蛋白均没有保守的RGD序列;变异株N-DHV:90D、04G在第50和51位比DHV-1多2个氨基酸(Q和D),在第147和185位各缺失1个氨基酸(E和L),而在变异株DHV:AP-03337、AP-04009、AP-04114、AP-04203的第145和146位比DHV-1多了2个氨基酸(G、G);不同血清型的鸭肝炎病毒在46-64位、95-149位、180-223位抗原指数差别较大,推测这些位点的改变可能影响病毒的生物学特性.     

鸭肝炎病毒地方株VP1基因的序列测定及分析

从湖北某发病鸭场分离到一株鸭肝炎病毒DHV/HB98,通过RT-PCR方法扩增该毒株的VPI基因的核苷酸序列.系统发育分析表明,DHV/HB98株的基因组序列与已发表的DHV-1 E53和ZJ的结构基因VP1亲缘关系最近,核苷酸的同源性为98.6％和98.3％,氨基酸序列的同源性为98.3％和98.7％,分析DHV/HB98与发表的变异株90D和04G核苷酸同源性为65.4％和66.7％,氨基酸同源性为69.5％和74.8％.推断该毒株属于DHV-1,与变异株是不同的血清型;DHV/HB98与DHV-1 ZJ具有相近的遗传关系,推断DHV/HB98也为强毒株.     

鸭肝炎病毒Js株VP1基因克隆及序列分析

摘要：通过PCR技术，从自行分离的鸭肝炎病毒Js株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段，并对该片段进行序列测定及分析。结果显示Js—VP1与DHV—A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92．7％～99．7％之间，与DHV—B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在58．5％～58．7％之间，与DHV—C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在61．6％-63．9％之间，分析表明Js株为鸭肝炎病毒基因A型，血清型分型为血清1型。进化树表明Js株与E53、X、R、AV2111株的亲缘关系较进。     

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(N-DHV)的变异情况,本实验从广西、河南、山东临床发病鸭体内分离到3株病毒.通过RT-PCR检测为N-DHV.将分离株进行鸭胚传代培养,并测定鸭胚毒的ELD50为10-3.29/0.2 mL～10-465/0.2 mL.以1型和N-DHV阳性血清分别与分离株进行血清交叉中和试验,结果表明,Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)阳性血清对分离株无保护性.动物回归试验表明,分离株致死雏鸭的临床症状和病变与DHV-1相同,分离株的致死率为30％～70％.将分离株接种鸡胚,不产生任何病变,在鸡胚成纤维细胞中连续传5代后,细胞产生明显、规律的病变.扩增3株分离株的VP1基因,并进行氨基酸序列比对,结果表明3个分离株与DHV-C的同源性最高,与DHV-A的同源性最低,并存在氨基酸的插入和缺失.本实验表明3个分离株与韩国N-DHV属于同一血清型.     

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定

对从广东地区流行鸭肝炎病例中分离到的1株病毒(命名为"GD株")进行了鸭胚(DE)传代培养.DE2～DE6代鸭胚毒的ELD50在10-5.17/0.2 mL～10-6.38/0.2 mL之间.DE6代毒回归雏鸭后可以产生与1型鸭肝炎病毒(DHV)相同的临床症状和解剖病变.鸭肝组织毒对4日龄、8日龄和16日龄雏鸭的LD50分别为10-6.5/0.5 mL、10-5.38/0.5 mL和10-4.83/0.5 mL.病毒对氯仿、乙醚和胰酶不敏感,能够耐受pH3.0酸处理,62℃30 min不能被完全灭活.病毒核酸类型鉴定为RNA病毒.生物学和理化学特性鉴定结果表明,GD株为强毒DHV.使用标准1型DHV阳性血清进行的交叉中和试验和交叉被动保护试验表明,GD株病毒在抗原性上与1型DHV无关.对DHv抗原相关的VP1基因序列分析和同源性比较表明,GD株与DHV-1的VP1核苷酸序列同源性为69.82%,氨基酸序列同源性为71.77%.GD株属于一种在我国流行的新型DHV强毒(暂命名为"CN-DHV").     

鸭甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析

通过PCR技术,从自行分离的鸭甲肝病毒JS株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段,并对该片段进行序列测定及分析。结果显示JS-VP1与DHAV-A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在62.0%~64.4%之间,与DHAV-B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在63.6%~63.8%之间,与DHAV-C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92.3%~98.5%之间,分析表明JS株为鸭甲肝病毒基因C型,血清型分型为韩国新型。进化树表明JS株与SD02株的亲缘关系较进,进一步说明VP1基因的核苷酸序列是DHAV基因组中的高度可变区,可作为DHAV基因型研究的标记,分离毒株为DHAV的防治及疫苗的设计奠定了基础。     

一株Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因组序列分析

为了研究Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)遗传变异情况,试验采用全基因组序列测定的方法对广东省佛山地区分离到的1株Ⅰ型鸭肝炎病毒进行分析研究。结果表明:不含poly(A)尾的DHV-Ⅰ基因组全长7 690 bp,只含有1个开放阅读框(ORF),编码2 249个氨基酸;将此病毒株与GenBank公布的其他DHV全基因序列进行序列分析,VP1蛋白变异最大,180～220位为高变区,与DHV-Ⅰ参考毒株核苷酸序列同源性在94.0%～97.4%之间,氨基酸序列同源性在97.5%～99.2%之间;对此病毒株进行遗传进化分析,与DHV-Ⅰ参考毒株处于同一分支,与韩国和中国台湾省新型鸭肝炎病毒处于不同分支。