鸡α干扰素基因的原核表达及其活性测定

应用RT-PCR技术,从被刺激诱导的鸡脾脏淋巴细胞中扩增鸡α-干扰素(ChIFN-α)基因cDNA,经克隆和测序后,构建原核表达重组质粒pGEX-proChIFN-α(全长序列)和pET-ChIFN-α(不含信号肽序列),并分别转化相应的表达菌.重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,ChIFN-α基因均获得表达,重组蛋白大小分别为45 ku、26ku左右,表达的蛋白以包涵体形式存在.表达产物经变性、提纯、复性,重组蛋白的含量约为1 mg/mL.复性后的ChIFN-α能够在鸡胚成纤维细胞上抑制H5N1禽流感病毒的复制;用水泡性口炎病毒检测结果表明,重组ChIFN-α具有较高的抗病毒作用,其生物学活性达到2×106 u/mg.     

人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白复性过程中研究的影响因素

将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG于37℃诱导培养获得表达.表达的包涵体经超声波破碎、洗涤后以6 mol/L的盐酸胍溶解,使蛋白彻底变性.然后按照试验设计,考察不同浓度组成的人工分子伴侣体系对不同浓度鸡IL-18重组蛋白复性率的影响.试验结果表明,利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在最佳的条件,优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率,且产物都具有良好的生物学活性,为鸡IL-18重组蛋白的进一步应用研究奠定了基础.     

重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究

为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID₅₀,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×2¹⁰ U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。     

禽流感H5亚型病毒血凝素基因的表达和抗原性分析

参考已发表的Guangdong/96/1(H5N1)基因序列设计引物,用鸡胚扩增中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存的病毒,收集尿囊液,提取病毒RNA,经RT-PCR扩增HA基因,将PCR产物平端克隆到pMD18-T中,经酶切、PCR及测序鉴定后,定向亚克隆到pET-30a表达载体中。重组子经酶切和测序鉴定为正确后,用IPTG诱导表达,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析重组蛋白的表达情况。重组蛋白r5HA经Ni-NTA His.Bind Resins纯化,并复性,用Western Blotting分析重组蛋白的抗原性。结果表明:表达产物大小约为65 ku,主要存在于包涵体中,表达量约占总蛋白的30%;同时,表达的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性,可以用作检测H5亚型禽流感病毒抗血清的捕获抗原。     

鸡β-防御素在大肠杆菌中的高效表达及复性

鸡β-防御素(gallinacin-3,Gal3)是鸡体内重要的防御因子,本试验研究了鸡Gal3融合蛋白在大肠杆菌中高效表达的规律,并探索了重组蛋白质的复性工艺.结果表明,加入诱导剂后1h,开始有可检出量的重组蛋白质表达,2h的表达水平已接近最大量;化学诱导剂IPTG 0.2～1.2mol/L对重组蛋白的产量没有明显影响.经Lablmage软件分析,融合蛋白的产量可达菌体总蛋白的35%以上,且主要以包涵体形式存在.将所获包涵体用8mol/L尿素溶解后,分步稀释于含有氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的复性系统中,重组蛋白得到完全复性.12mg/L复性的重组鸡Gal3能抑制肠炎沙门氏菌的生长,24mg/L能抑制肠致病型大肠杆菌的生长.     

鸡γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究

将克隆的鸡γ-干扰素(Ch IFNγ)基因亚克隆至酵母表达载体p PICZα-A中,构建重组质粒p PIC-Ch IFNγ。将鉴定正确的质粒p PIC-Ch IFNγ线性化,通过电转化整合到毕赤酵母菌株X-33基因组中,得到阳性菌株。经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明Ch IFNγ在酵母中获得了分泌型表达,表达产物分子量约为20 ku。表达产物粗提后以细胞病变抑制法检测其活性,效价为107.69U/m L;在鸡胚中能有效抑制H9N2亚型禽流感病毒的增殖;动物攻毒保护试验结果显示,表达的蛋白具有较好的抗病毒活性。     

鸡α干扰素的原核表达及纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。     

重组鸡IFN-α-IL-18融合基因的酵母分泌表达及其抗IBDV活性研究

为探讨鸡IFN-α和IL-18及其融合蛋白抗IBDV活性,本研究将鸡IFN-α、IL-18及其融合基因分别置于酵母表达载体pPICZ-αA的AOX1启动子下游,构建重组质粒pPICZ-IFN-α、pPICZ-IL-18和pPICZ-IFN-α-IL-18。将重组质粒分别用PmeⅠ酶切线性化,电穿孔方法导入酵母Pichia Pastoris X-33感受态细胞,以1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白,淋巴细胞转化试验初步检测表达产物生物学活性,鸡胚接种试验对表达产物的抗IBDV效果进行评价。结果表明,在酵母培养上清液中存在相对分子质量分别为22 000、23 000和43 000的目的蛋白,表达的IL-18和IFN-α-IL-18对鸡淋巴细胞具有明显的诱导转化作用(P0.05)。IFN-α-IL-18融合蛋白能够显著抑制IBDV在鸡胚中的增殖(P0.01),IFN-α和IL-18酵母表达产物对IBDV也有明显的抑制作用(P0.05)。这为进一步开展IFN-α-IL-18融合蛋白的功能研究及其在鸡病毒性疫病防控中作用的探索奠定了基础。     

猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

提取经 Con A诱导培养的猪外周血白细胞总 RNA,RT- PCR扩增出猪 IFN- γ基因并克隆到 p GEM- T- easy载体 ,测序结果表明 ,扩增片段为含有信号肽的猪 IFN-γ完整基因。亚克隆猪 IFN-γ成熟蛋白编码基因 ,并对其 5′段前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。通过引入 SD序列 ,成功构建了猪 IFN- γ原核双顺反子表达载体 p L CS-po IFN2 G,并实现了猪 IFN-γ在大肠杆菌中的高表达 ,约占菌体总蛋白的 5 6 .5 %。表达产物以包涵体形式存在 ,用含 7mol/L 盐酸胍的变性液溶解及含 0 .5 mol/L盐酸胍复性液复性处理 ,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后 ,细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪 IFN-γ具有较高干扰素活性     

猪γ干扰素的体外表达及其多克隆抗血清的制备

从健康仔猪前腔静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,用猪γ干扰素(IFN-γ)基因特异性引物通过RT-PCR扩增猪IFN-γ的全长cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中,再亚克隆到pUC18和表达载体pET-30a中,经测序发现其序列与GenBank报道的IFN-γ基因序列基本一致.将重组质粒pET-30a-IFN-γ转化大肠杆菌BL21,于37℃经IPTG诱导表达,IFN-γ基因获得表达,表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39%.经SDS-PAGE及Westernblot分析表明,表达的融合蛋白分子量约为25 ku.将包涵体用8 mol/L脲变性,用ProBondTM Purification Systerm纯化,经透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0.3 mg/mL.将复性蛋白免疫新西兰白兔三次,制备了高滴度的猪IFN-γ抗血清.本实验表达和纯化了猪IFN-γ,并制备兔抗猪IFN-γ的抗血清,为下一阶段关于猪γ干扰素重组蛋白其应用奠定了基础.     

表达鸡γ-干扰素重组鸡传染性支气管炎病毒的构建及鉴定

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究以IBV疫苗株H120为病毒载体,在其非结构蛋白5a编码区上游插入鸡γ-干扰素(Ch IFN-γ)基因,通过反向遗传操作技术构建重组病毒。经RT-PCR和测序鉴定表明拯救获得重组病毒(r H120-c IFNγ/5a)。生物学特性研究结果表明,r H120-c IFNγ/5a感染鸡胚后能够引起特征性病变,但与其亲本病毒株H120相比,病毒的毒价及其在鸡胚中的复制能力有所下降。将r H120-c IFNγ/5a在鸡胚中连续传代,采用RT-PCR进行检测,结果表明Ch IFN-γ基因在病毒传至第9代时仍保持稳定,至第12代Ch IFN-γ基因出现部分或完全丢失现象。本研究结果为进一步研制以IBV为载体的新型基因重组疫苗奠定了基础。     

鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达及多克隆抗体的制备

将克隆得到的鸡 IFN- γ基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体 p PROEXTMHT的 Pst 和 Kpn 位点上 ,构建了重组表达质粒 p PROEXTMHT- IFN -γ,经序列分析鉴定 ,确证目的基因克隆入载体的预期位点。将重组质粒转化大肠杆菌 DH5 α,于 37℃不同时间诱导培养 ,SDS- PAGE电泳表明 ,该基因在大肠杆菌中发生高水平表达 ,表达的鸡 IFN- γ融合蛋白相对分子质量约为 2 2 0 0 0。重组蛋白占菌体总蛋白的 33%。经 Western blot鉴定 ,该重组蛋白质具有生物学活性。包涵体被 6 mol/ L 盐酸胍裂解后 ,通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡 IFN- γ融合蛋白及其纯化产物经 3次肌肉注射于新西兰白兔 ,制备了兔抗鸡 IFN- γ多克隆抗体。琼脂扩散结果表明 ,多克隆抗体可与纯化的鸡IFN -γ重组蛋白发生特异性反应     

表达鹅γ干扰素重组禽痘病毒的构建及其抗病毒活性的初步研究

为研究表达鹅γ干扰素(GoIFN-γ)基因重组禽痘病毒的抗病毒活性,本研究构建了在禽痘病毒(FPV)早晚期启动子LP2EP2控制下的IFN-γ基因重组禽痘病毒转移载体,将其转染至亲本禽痘病毒S-FPV-017预感染的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF),使其与禽痘病毒基因组进行同源重组,经过9轮筛选和纯化并进行PCR和间接免疫荧光检测,获得能稳定表达外源基因的重组病毒r FPV-IFNγ-LacZ。利用细胞病变抑制法检测抗病毒活性结果显示,在鸡胚成纤维细胞中重组禽痘病毒表达的IFN-γ对鹅细小病毒的复制具有显著抑制作用。本研究为制备共表达保护性抗原和γ干扰素基因的重组基因工程疫苗研究奠定基础。     

口蹄疫病毒VP1-3免疫表位基因与猪γ-干扰素基因的融合表达

将人工合成的口蹄疫病毒VP1-3上的抗原表位基因和猪γ-干扰素基因串联入原核表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定及测序表明重组载体中二者以接头融合的形式构建成重组表达质粒。将该质粒转化BL21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,重组蛋白分子量约为66 Ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示表达的重组蛋白占菌体总蛋白的37.4%,且主要以包涵体的形式存在。包涵体以SKL变性后,经PEG4000、氧化型谷胱苷肽和还原型谷胱苷肽复性。粗提产物以CPE_(50)测得重组蛋白在MDBK细胞上的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的活性达到1600 U/mL,说明表达产物具有干扰素的生物学活性,为下一步基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白克隆表达与免疫原性检测

本文以IBV N蛋白为研究对象,首先从鸡胚培养的IBV ZY3毒株尿囊液中提取基因组RNA,然后利用软件对其N蛋白抗原表位进行预测分析,设计一对特异性引物对免疫原性好、亲水性强、表位可能性大的保守片段进行扩增,片段大小为818 bp;将扩增产物与表达载体pET-32a(+)连接并转入大肠杆菌BL21中诱导表达,用SDS-PAGE检测表达的重组N蛋白大小为50 kDa;用Ni-NTA Superflow纯化重组N蛋白后,采用抗鸡IBV血清与之进行Western blot反应,检测其免疫原性,结果显示重组蛋白免疫原性良好。该结果对进一步研究IBV N蛋白及建立鸡传染性支气管炎的诊断方法有重要意义。     

表达绿色荧光和红色荧光蛋白重组新城疫病毒的构建

试验旨在探究以新城疫病毒为载体进行多联疫苗的构建。通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和红色荧光蛋白(Ds Red)基因用T2A肽串联后克隆入嵌合新城疫病毒AI4-2FHN的P和M基因之间,获得重组质粒p AI4-2FHN-GRFP。该质粒与p CI-NP、p CI-P和p CI-L 3个辅助质粒共转染至稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR细胞后,获得可同时表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的重组新城疫病毒。拯救病毒在SPF鸡胚中繁殖传代,通过RT-PCR验证,并检测重组病毒的生物学活性和外源蛋白的表达效率。结果显示:重组病毒在鸡胚内传3代后,鸡胚尿囊液HA效价稳定在8 log_2,感染细胞24 h、36 h、48 h后在荧光显微镜下观察到EGFP与Ds Red的荧光亮度逐渐增强,且相同时间内红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白表达量相似。重组病毒的构建为新城疫病毒作载体用于多联多价疫苗的研发提供了参考。     

鸡β干扰素的原核表达及抗病毒活性检测

根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中发表的鸡β干扰素基因序列进行密码子优化与人工合成,构建原核表达质粒pET-28b-ChIFN-β,重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物主要以包涵体形式存在。包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化后,SDS-PAGE、Western blot分析表明pET-28b-ChIFN-β表达正确,并且表达量较高。重组鸡β干扰素蛋白在DF-1细胞上能明显抑制水疱性口炎病毒繁殖,抗病毒活性达2.73×10~6UI/mg。本研究结果为鸡β干扰素在临床防治禽类病毒性疾病的探索奠定了基础。     

鸡IFN-γ DNA壳聚糖纳米粒的制备及外源基因表达

为检测纳米载体对表达重组质粒的保护效果,本实验构建了鸡γ干扰素(IFN-γ)真核表达重组质粒pCAGGS-ChIFN-γ;并将其与200μg/mL壳聚糖醋酸溶液制备成DNA/壳聚糖纳米颗粒(CNPs)。透射电镜观察CNPs呈不规则球形,光子相关色谱(PCS)仪测定显示CNPs的平均粒径为172.6nm±5.1nm;Zeta电位为20.8mV±2.9mV;CNPs重组质粒包埋效率和载药量分别为91.21%±2.54%和31.93%±0.16%。鸡胚成纤维细胞(CEF)体外转染实验表明:携带的外源基因能在CEF中释放、表达,其表达效率约为阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000转染后的16.3%,同时CNPs对细胞基本无毒性。CNPs稳定实验也证实其稳定性良好。     

鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

本研究构建了表达鸡-γ-干扰素（Chicken interferon-γ，ChIFN-γ）的重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ。采用鼠抗ChIFN-γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光（1FA）及间接ELISA检测，表明ChIFN-γ在重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。细胞病变抑制法测定重组ChIFN-γ抗病毒活性试验显示，重组杆状病毒表达ChIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的复制。而且其抗病毒活性可以被鼠抗ChIFN-γ免疫血清阻断。试验结果表明，重组杆状病毒能良好表达ChIFN-γ，并具有高效抗病毒活性。     

牛IFN-α基因高效表达及纯化的研究

基于对RNA二级结构的预测和密码子偏性计算,通过计算机辅助软件进行牛IFN-α基因优化,经人工合成优化后的基因与pWL表达载体连接后诱导表达,并对表达条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,其产物分子量约为17ku,最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的33％,表达产物以包涵体形式存在。经过包涵体溶解、初步复性后利用CM Sepharose Fast Flow离子交换层析柱作为蛋白质复性系统,采用梯度法进行牛α-干扰素包涵体蛋白质的纯化复性。结果表明,梯度离子交换层析法能有效地复性牛α-干扰素包涵体,复性后的重组牛α-干扰素的纯度达95％,通过离子交换层析柱纯化和复性后,重组牛α-干扰素在MDBK/VSV细胞系上的抗病毒活性为5．56×10^6 u／mg。