大田软海绵酸人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

采用活化酯法将大田软海绵酸(OA)与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备免疫抗原(OA-KLH),用还原聚丙烯酰胺凝胶电泳法和红外光谱法对人工抗原的偶联效果进行分析,通过免疫兔子制备抗体,所得抗血清经Protein A凝胶层析柱纯化处理后,用紫外全波长扫描和间接竞争ELISA法验证纯化效果。结果表明,免疫抗原偶联成功并获得了高亲和力的多克隆抗血清,抗血清纯化后浓度为2.16 mg/mL,间接竞争ELISA测定其滴度为12 800、IC₁₅为3.41 ng/mL,为建立快速、经济的检测方法打下了基础。     

应用改良的碳二亚胺法制备无色孔雀石绿完全抗原及鉴定

为完善无色孔雀石绿的免疫检测方法,通过改良的碳二亚胺法,改造无色孔雀石绿结构类似物副品红半抗原.经过紫外分光法、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、质谱法鉴定,偶联反应成功,且偶联比最高达37∶1.以副品红一牛血清白蛋白偶联物为完全抗原免疫Balb/c小鼠,产生针对无色孔雀石绿的多克隆抗体,效价可达...     

酶联免疫吸附方法分析海水和贝类中的滴滴涕及代谢物

采用间接竞争酶联免疫吸附分析(Ind irect Competitive Enzym e-linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法测定海水样品和海洋贝类中的有机氯农药滴滴涕及其主要代谢产物的含量。采用碳二亚胺法,将半抗原DDA分别与载体蛋白牛血清白蛋白(Bovine serum album in,BSA)和卵清蛋白(Ovalbu-m in,OVA)偶联,得到包被抗原和免疫抗原。以DDA-OVA作为免疫抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,免疫数次后,测定血清中抗体效价。以DDA-BSA为包被抗原,免疫多克隆抗血清为多克隆抗体,建立间接竞争酶联免疫吸附方法分析检测海水样品和海洋贝类中的有机氯农药二氯二苯三氯乙烷(DDT)及其代谢产物2,2-双(4-氯苯基)乙酸(DDA)、2,2-双(4-氯苯基)-1,1-二氯乙烷(DDD)、2,2-双(4-氯苯基)-1,1-二氯乙烯(DDE)的方法。最低检出限分别为DDT:25 ng/m l,DDA:1.56 ng/m l,DDD:25 ng/m l,DDE:25 ng/m l。贝类样品DDA回收率为96.37%~100.88%,批内变异系数为2.28%~5.13%;贝类样品DDT回收率为93.86%~100.08%,批内变异系数为4.71%~7.68%;海水样品DDT回收率88.23%,批内变异系数6.60%。     

斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白抗体的制备

将含有斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）神经坏死病毒（orange-spotted grouper nervous necrosis virus，OGNNV）的主衣壳蛋白（main capsid protein，MCP）基因的重组质粒pET32a-MCP转入大肠杆菌BL21后，用异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，用柱层析纯化表达的融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，制备抗MCP融合蛋白的血清。用ELISA方法检测抗血清的效价，用Western—blot检测抗血清的特异性。结果显示，获得的抗血清稀释1：22000倍时仍呈阳性，并能有效中和OGNNV，实验组的相对存活率达54．50％。这说明，本研究用纯化的MCP融合蛋白制备兔抗OGNNVMCP抗体是成功的，并证实了OGNNV主衣壳蛋白的免疫原性。本研究旨为重组表达主衣壳蛋白基因制备抗OGNNV疫苗提供科学依据，并为进一步研究提供重要的实验材料。     

企鹅珍珠贝镉金属硫蛋白的分离纯化及其多克隆抗体的制备

镉—金属硫蛋白(Cd-MT)是水生环境中重金属镉污染的重要生物标志物,对该蛋白的研究不仅有利于Cd-MT免疫学检测方法的建立,也为水生环境重金属污染监测技术的开发提供理论依据。采用不同浓度CdCl₂(0～0.8 mg/L)胁迫诱导企鹅珍珠贝合成Cd-MT,通过组织捣碎、冷冻离心、热处理、Sephadex G-50凝胶柱层析等方法从企鹅珍珠贝全脏器中纯化得到Cd-MT。紫外吸收显示,在CdCl₂浓度为0.8 mg/L时,MT粗提液中的Cd-MT特征吸收最大,表明贝体内的Cd-MT含量随着CdCl₂胁迫浓度的增大而增加。SDS-PAGE显示纯化后的Cd-MT及其二聚体分子量约为9 ku和18 ku。采用戊二醛法将获得的Cd-MT与牛血清白蛋白(BSA)偶联后免疫家兔,制备了兔抗企鹅珍珠贝Cd-MT多克隆抗血清。通过间接ELISA法检测其抗血清效价为1∶12 800。经饱和硫酸铵法和DEAE-Sephadex A50亲和层析纯化得到分子量约为35 ku的高纯度免疫球蛋白G(IgG)。ELISA免疫鉴定显示,该IgG不仅能识别企鹅珍珠贝的Cd-MT,还与马氏珠母贝的Cd-MT有明显的免疫交叉反应。     

鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析

从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。     

环丙沙星单克隆抗体的制备及其特性分析

以人工合成的牛血清白蛋白环丙沙星抗原(CPFX-BSA)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CPFX - BSA的McAb,获得1株稳定分泌针对CPFX药物的单克隆抗体细胞株5G4,腹水效价达1.28×10-6；SDS - PAGE电泳分析CPFX McAb 5C4蛋白重链和轻链的分子量约为50KD和25KD；抗...     

霍乱弧菌TcpA蛋白的表达及其免疫活性分析

采用PCR方法从鱼源霍乱弧菌Y1株（Vibrio cholerae Y1）扩增毒素共调菌毛蛋白A(toxin-corcgulated pilin A,TcpA)基因并克隆至pMD 18-T载体.序列分析显示tcpA基因ORF长675 bp,编码224个氨基酸(GenBank登录号EU649677).同源性比对发现,该基因与GenBank中登录的7个霍乱弧菌参考株相应基因序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性均很高,分别为99.6％～ 99.7％和98.7％～ 99.1％,表明TcpA蛋白相当保守.将tcpA基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,并进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现分子量约为47.0 kD的重组TcpA融合蛋白主要以包涵体形式表达.Western blot检测结果显示,重组TcpA融合蛋白可与鼠抗Vc Y1菌株菌毛蛋白抗血清发生特异性结合反应.用纯化的重组TcpA融合蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)制备抗血清,双相免疫扩散试验检测抗体效价达1:16,且该抗血清能够明显抑制Vc Y1菌株对HEp-2细胞的黏附.草鱼免疫后第25天用Vc Y1菌株攻毒,结果相对免疫保护率达到73.33％.研究结果表明,组TcpA蛋白仍保留着天然菌毛蛋白的免疫原性、免疫反应性和免疫保护性,重组TcpA蛋白可作为霍乱弧菌的候选诊断抗原和疫苗抗原.     

水产品中磺胺二甲嘧啶间接竞争ELISA检测法的建立

将磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine,SM2）与牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）偶联,分别作为免疫原及包被原,建立了水产品中磺胺二甲嘧啶间接竞争ELISA检测方法。实验结果表明,理想的磺胺二甲嘧啶人血清白蛋白（SM2-HSA）包被抗原浓度为1mg／L,酶标二抗（羊抗兔IgG-HRP）工作浓度为1／1000,多抗（SM2-PcAb）工作浓度为1／3 200,最适检测范围为10～200μg／L,最低检测限为1．89μg／L,本实验所建立间接竞争ELISA检测方法的孔间差异为2．56％,板间差异为5．14％,实验重复性好。在实验浓度范围内,磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine）的抗血清与磺胺嘧啶（Sulfadiazine）、磺胺甲嗯唑（Sulfamethoxazole）、氯霉素（Chloramphenicol）、恩诺沙星（Enrofloxacin）、甲氧苄啶（Trimethoprim）、呋喃唑酮（Furazolidone）等可能会因同时使用而导致共同残留的抗菌药物未显示免疫交叉反应性,与结构相近的磺胺类药物磺胺嘧啶的交叉反应性为11．0％。所建立的方法有较高特异性和灵敏度,适合磺胺二甲嘧啶的快速筛选。整个测定时间为5～6h。     

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表达

根据哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计一对引物，应用聚合酶链式反应（PCR）方法，从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEM-Teasy载体，测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因。用PCR方法去除其信号肽序列，定向克隆到原核表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒pGEX-4T-OmpK。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GST-OmpK融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Western-blotting分析表明，它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应，提示外膜蛋白OmpK可能是哈维氏弧菌的重要保护性抗原之一。     

Estimation of variation of virulence of Renibacterium salmoninarum by survival analysis of experimental infection of salmonid fish

The variation of virulence of Renibacterium salmoninarum , the causative agent of bacterial kidney disease (BKD) in salmonid fish, was studied by infecting rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), with two isolates (strains 325 and 932) from diseased Atlantic salmon, Salmo salar L., and one isolate (strain 4366) from an apparently healthy Atlantic salmon. Coho salmon, Oncorhynchus kisutch (Walbaum), were injected with the strain 932 to estimate difference in fish species resistance. Fish were removed by random sampling for other study purposes, a study design possible with analysis of lifetime distributions incorporating both sampling-, death- and survival-times. At the end of the experiment, the rainbow trout infected with strains 325, 932 and 4366 had a survival probability of 33%, 51% and 72%, respectively. The coho salmon infected with strain 932 had a 26% survival probability. The strain differences were significant according to the log-rank test, and the risk ratio between the strains ranged from 1·8 to 5·4. The strain from the apparently healthy fish was least virulent. The survival of the fish species was different over time. Rainbow trout were more likely to die early in the time course, but high numbers of coho died later, resulting in an overall risk of mortality of 1·4 in favour of rainbow trout. Differences in virulence may reflect changed selective pressure on R. salmoninarum when introduced from feral stocks into the environment of fish farms.     

母猪胎衣不下的病因与防治要点

猪的胎盘属于弥散型胎盘,这种胎盘的结构特点和饲养管理的不当,常常导致母猪胎衣不下发生,给生猪的生产繁殖带来极大损失。本文针对母猪胎衣不下发生病因、综合防治进行详细阐述,旨在对预防和治疗胎衣不下能有所帮助。     

水硬度对七彩神仙鱼幼鱼发育的影响

采用不同硬度的水对七彩神仙鱼幼鱼进行饲养。6周龄幼鱼在硬度为7.94°dH±0.30°dH时饲养84d后,比在硬度为14.71°dH±0.23°dH水中的幼鱼个体大,生长速度快。表明较高硬度的水有利于七彩神仙鱼幼鱼的生长发育。     

虎斑乌贼受精卵卵黄营养成分分析

本实验对虎斑乌贼受精卵卵黄的营养成分进行分析,旨在探讨其幼体的营养需求量,为其幼体配合饲料研制提供参考数据。随机选取大约800个虎斑乌贼受精卵的卵黄,采用国家标准方法测定其水分、灰分、粗蛋白质、粗脂肪、氨基酸、脂肪酸和矿物元素含量。结果表明:1)虎斑乌贼受精卵卵黄中粗蛋白质含量为76.33%(干重基础);总氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分别为71.22%和32.38%(干重基础),EAA/TAA为45.46%,氨基酸中以谷氨酸(Glu)含量最高(9.97%),必需氨基酸中亮氨酸(Leu)含量最高(7.58%)。2)其粗脂肪含量12.71%(干重基础);共检出17种脂肪酸,包括8种饱和脂肪酸(SFA)、5种单不饱和脂肪酸(MUFA)和4种多不饱和脂肪酸(PUFA),SFA、MUFA和PUFA分别占脂肪酸总量的43.47%、7.54%和49.25%,其中以DHA含量最高,达32.80%,EPA含量为7.70%,DHA/EPA为4.26。3)检测出Na、K、Ca、Mg、Sr、Mn、Fe、Cu、Zn、Al和As 矿物元素,微量元素中富含Zn、Al和Fe,含量分别为 0.77、0.71和0.43 mg/kg(鲜重基础)。由此可见,卵黄具有高蛋白、低脂肪,富含n-3PUFA的特点;虎斑乌贼幼体饲料中蛋白质需求量参考值为76.33%;氨基酸需求量参考值,如赖氨酸(Lys)为5.49%,蛋氨酸(Met)为2.63%;脂肪的需求量参考值为12.71%,DHA为4.17%,EPA为0.98%;微量元素需求量参考值,如Zn为2.77 mg/kg,Cu为0.19 mg/kg(干重基础)。     

斑节对虾虾苗活力检测方法

该研究通过肉眼观察、镜检，进行干露、饥饿、盐度突降、福尔马林等抗性试验，并采用病毒检测等方法，以期建立评估斑节对虾（Penaeus monodon）虾苗活力和质量标准。结果表明，斑节对虾健康虾苗具有趋光性、集群性，体表光洁，肌肉透亮，肠胃食物充盈等特性。测试虾苗干露时间以15min为宜，健康虾苗干露后能立即恢复活力，而病弱虾苗多出现死亡、昏迷现象；虾苗的成活率随饥饿时间的延长而降低，随福尔马林浓度升高和时间延长而降低，随盐度突降幅度增加而降低。健康虾苗能忍受100～200μL·L^-1福尔马林溶液30min，成活率近100％；在盐度20～30下虾苗的成活情况较好，而其在淡水中仅能存活1h。对虾苗进行病毒检测，可以避免养殖中因虾苗携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。     

金鳟、虹鳟苗种长途运输实例

鳟鱼发眼卵和旨种运输是养鳟生产的重要环节。发眼卵多在冬季和早春运输，苗种多在晚春和夏季运输。苗种运输大多以鱼篓充氧进行短距离汽车运输，长途运输冷水性鱼苗种的实例很少。本文总结了金鳟和虹鳟苗种长途运输方法，以期与养鳟业界共同交流提高。一、包装材料和方法内包装材料是苗种运输专用塑料袋，规格54×104cm，外包装是泡沫塑料箱，规格63.5×45.5×30．5cm，纸箱规格64×46×32．5cm。塑料袋采取双层式，内装苗种和水共12.5kg，其中苗种0.5-1．3kg，100－2000尾。起运前苗种停食1－2天。运鱼用水水温调至6℃，鱼、水入袋后袋内…     

Characterization of protease inhibitors of seminal plasma of cyprinids

Anti-proteinase activity was demonstrated in the seminal plasma of cyprinid fish species (bream, chub, ide, dace, asp, goldfish, roach, common carp) using electrophoretic techniques combined with a detection method based on inhibition of bovine trypsin. We found species-specific protease inhibitors in the seminal plasma of cyprinids. At least three bands of protease inhibitors with different migration rates could be identified by native PAGE. Higher variability was characterized for bands with slower migration rates. Visualization of inhibitors after SDS-PAGE under non-reducing conditions allowed estimation of their molecular weights. Apparent molecular weights were within the range of 51–59 and 47–54 kDa for the bands with slower and moderate migration rates, respectively. The molecular weight of fast migration bands for roach and common carp were estimated to 23 and 30 kDa, respectively. Inhibitors of common carp seminal plasma differed in their affinity toward serine proteases. Three inhibitors in common carp seminal plasma could be visualized using cod and bovine trypsin, but only two inhibitors (of high molecular weight) were recognized with chymotrypsin. There were differences in anti-proteinase activity and seminal plasma protein concentration in relation to the origin of common carp seminal plasma (breeding lines) and time of milt collection (spawning vs. post-spawning season).     

牙鲆刺激隐核虫病的防治

2005年七、八月份,乐亭、滦南一带多家工厂化牙鲆养殖场发生刺激隐核虫病,此种病虫害发病急、传染快、死亡率高。发生过该病的养殖场牙鲆死亡率一般都在50％～80％之间,这种病害给牙鲆养殖业带来很大损失。     

不同年龄细鳞鱼的繁育效果

研究了不同年龄组(3～8龄)细鳞鱼(Bachymystax lenok Pallas)亲鱼的繁育效果,分析其繁育主要技术,包括亲鱼培育、繁育技术、受精卵孵化、鱼苗培育等,结果发现,5～6龄和7～8龄细鳞鱼产卵量没有明显差异,产卵量、孵化率、出苗率均较高,繁殖效果明显好于3～4龄亲鱼。     

海口市近海渔业资源衰退的原因分析与对策建议

在分析海口市海洋渔业资源和海洋捕捞现状的基础上，提出了近海渔业资源衰退的6项原因和加快保护和修复资源的10项措施和建议。