草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ的融合表达、纯化和抗血清制备

采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX-4T-1载体中,构建草鱼IGF-Ⅰ融合蛋白表达质粒pGEX-IGF.质粒转化大肠杆菌BL21菌株.该菌株经IPTG诱导可表达分子量约34kD的特异蛋白.在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白.经30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST-IGF.以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF-Ⅰ的抗血清.凝胶双扩散试验显示抗血清效价为1:64,说明表达产物具免疫原性.     

草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。     

草鱼胰岛素样生长因子—I的融合表达、纯化和抗血清制备

采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子-I（IGF-I）cDNA。使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX-4T-1载体中,构建草鱼IGF-I融合蛋白表达质粒pGEX-IGF。质粒转化大肠杆菌BL21菌株,该菌株经IPTG诱导可表达分子量约34kD的特异蛋白。在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白,经30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后,裂解液上清经glutathione sepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST-IGF。以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF-I的抗血清,凝胶双扩散试验显示抗血清效价为1：64,说明表达产物具免疫原性。     

草鱼胰岛素样生长因子-I的融合表达、纯化和抗血清制备

采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )cDNA ,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX 4T 1载体中 ,构建草鱼IGF I融合蛋白表达质粒pGEX IGF。质粒转化大肠杆菌BL2 1菌株。该菌株经IPTG诱导可表达分子量约 34kD的特异蛋白。在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白。经 30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后 ,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST IGF。以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF I的抗血清。凝胶双扩散试验显示抗血清效价为 1∶6 4 ,说明表达产物具免疫原性     

草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白功能及免疫原性分析

在前期研究中分离到一株草鱼呼肠孤病毒,GCRV-GD108,并获得其全基因组序列.该病毒株的M5基因编码VP5蛋白,该蛋白与哺乳动物正呼肠孤病毒μ2蛋白具有较高的同源性及相似的NTPase结合保守区域,推测VP5蛋白也同样具有NTPase活性.为检测VP5蛋白是否具有NTPase活性及其是否具有免疫保护作用,采用已构建的原核表达载体表达VP5重组蛋白,通过孔雀绿钼酸铵法检测纯化后的重组蛋白的NTPase活性.采用DNAstar软件预测M5基因编码蛋白的抗原性,综合蛋白亲水性、表面可及性与表面抗原性三项指标,预测编码蛋白可形成抗原表位的氨基酸区域数多达86个,提示VP5蛋白具有较强的免疫原性.用重组蛋白VP5免疫健康草鱼,通过人工攻毒实验检测VP5蛋白的免疫保护作用.结果显示,VP5重组蛋白具有NTPase活性,且其NTPase活性依赖于Mg2+或Na+/K+,而Ca2+的存在可能抑制其活性;VP5蛋白可诱导草鱼产生高水平的抗体滴度,并显著提高IgM mRNA的表达水平,但未能为草鱼提供抗GCRV感染的保护.研究首次证实GCRV-GD108株VP5蛋白具有NTPase活性,但不能为草鱼提供免疫保护作用.     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaB基因的克隆及原核表达

参照GenBank上登录的弧菌鞭毛蛋白flaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaB全长基因,序列分析结果显示该基因为1134bp,编码377个氨基酸。与GenBank中其它弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaB基因与副溶血弧菌flaB基因的同源性最高(92%)。将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出带His-tag的融合蛋白,分子量大小与预期一致。优化的表达条件为28℃,0.4mmol/LIPTG浓度诱导10h。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,制备了多克隆抗体。Western-blotting结果表明鼠抗FlaB血清不仅能与诱导后的重组蛋白发生反应,而且能与天然的溶藻弧菌全菌蛋白发生反应,提示鞭毛蛋白FlaB可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一,为下一步进行FlaB蛋白免疫原性的研究以及疫苗的制备奠定了基础。     

鲈PPARγ基因的克隆、组织表达及其抗体制备

根据GenBank上其他物种的PPARγ基因序列设计兼并引物,从鲈肝脏cDNA中扩增得到鲈PPARγ基因cDNA序列1 588 bp,分析表明该基因的开放阅读框为1 569 bp,编码522个氨基酸,理论等电点6.06,分子量59.02 ku。将鲈PPARγ氨基酸序列比对后发现与欧洲鲈同源性最高,为93.1%;与金头鲷的同源性为92.3%,与人同源性也达到为61.8%。用RT-PCR分析该基因组织表达模式,结果表明,鲈PPARγ主要分布于肝脏、鳃和脂肪组织。将鲈PPARγ开放阅读框1 569 bp序列克隆至原核表达载体pET-28a(+)构成pET-28a-PPARγ1569重组体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以终浓度1 mmol/L的IPTG对其进行诱导表达4 h,SDS-PAGE电泳分析表明,pET-28a-PPARγ1569菌株在66 ku 处有1条特异的蛋白带,Western-blotting 检测表明该蛋白为鲈PPARγ融合蛋白。用镍离子亲和柱纯化的鲈PPARγ融合蛋白免疫小鼠得到其多克隆抗体。用间接ELISA法检测鲈PPARγ抗体的抗体效价约为1∶16 000。实验结果为进一步研究鲈PPARγ蛋白的生物学特性及功能奠定了基础。     

剑尾鱼卵黄蛋白原基因片段克隆、表达及蛋白检测方法的建立

本研究通过对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵黄蛋白原基因片段的克隆和表达,建立了剑尾鱼卵黄蛋白原蛋白检测方法.根据已发表的底鳉(Fundulus heteroclitus)卵黄蛋白原mRNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出1段1 118 bp的剑尾鱼卵黄蛋白原cDNA片段,序列分析表明该片段与其他鱼类卵黄蛋白原基因序列相似性较高,其中与底鳉和食蚊鱼(Gambusia affinis)的同源性分别达87.4%和96.7%.在对该片段所编码氨基酸序列可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,预期得到258个氨基酸的表达蛋白.表达载体转入大肠杆菌DH5α,经热诱导后,SDS-PAGE分析有29 kD的表达蛋白产生,与预期相符.以重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗血清.雌激素(β-雌二醇)对剑尾鱼诱导后,用重组蛋白抗血清作一抗,进行Westernblot分析.结果表明,该抗血清能与剑尾鱼卵黄蛋白原特异结合,可应用于剑尾鱼卵黄蛋白原的检测.卵黄蛋白原是环境雌激素研究中较为特异、灵敏的生物标志物,剑尾鱼卵黄蛋白原检测方法的建立,为剑尾鱼环境监测应用提供良好基础.     

抗冻蛋白AFPⅢ的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

采用基因重组技术将AFPⅢ基因与原核表达载体pET32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果.用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫6-7周龄的小白鼠,制备AFPⅢ多克隆抗体,采用Western印迹法检验抗体特异性.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定多克隆抗体滴度.成功地构建了AFPⅢ的原核表达载体,经在大肠杆菌中诱导表达、镍柱亲和层析纯化,得到较纯的相对分子质量约26 000 Da的融合蛋白,免疫小白鼠后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与AFPⅢ蛋白特异性结合.该试验为进一步研究AFPⅢ在转基因鱼中的定点表达以及作用机制奠定了基础.     

草鱼小肽转运载体PepT1基因的克隆与表达特征

采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的11个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守;系统进化分析表明,草鱼PepT1基因与鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-time PCR技术检测了该基因的时空表达,结果显示,PepT1在草鱼前肠组织表达量最高,其次是肌肉组织;草鱼出膜7 d后PepT1 mRNA表达量相对稳定;昼夜节律研究发现,肠道PepT1基因夜间的表达量较白天高。本研究旨在为小肽转运载体PepT1介导肠道转运小肽调控草鱼对饲料蛋白消化吸收的分子机理提供理论基础。     

中国对虾糠虾幼体病原菌（非01群霍乱弧菌）的研究

本文对中国对虾糠虾幼体的一种病原菌———非０１群霍乱弧菌作了研究报道。这种病的症状是病虾运动能力差、趋光性弱、镜检发现肠道肿胀。从垂死病虾中分离到５株细菌，经感染健康糠虾幼体得到与病虾相同症状。５株细菌的４７项形态及生理生化特性与霍乱弧菌相同，但不被０１群霍乱弧菌多价血清凝集。血清学分型结果均为不同的ＶＢＯ血清型ＶＢＯ５，１４，２６，４７，５６。用ＤＮＡ霍乱ＣＴ基因探针菌落原位杂交及小鼠肠结扎法测肠毒素，表明菌株有强毒力。分离菌株对小鼠的ＬＤ５０为１５８×１０８个／只。     

基于lolB基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测病原霍乱弧菌方法的建立

基于霍乱弧菌lolB基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测霍乱弧菌的方法。常规PCR检测仅霍乱弧菌扩增出大小为519bp的目的片段,其他3种病原弧菌均为阴性;SYBR GreenⅠ实时定量PCR,在Tm为86.5～87℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性。SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;所制作的标准曲线在2.59×108～2.59×100拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.993,能对霍乱弧菌进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单、耗时短,是霍乱弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及流行病调查的有效方法。     

Availability of environmental and dietary calcium in tiger puffer

Tiger puffer, Takifugu rubripes, juveniles were fed with four semi-purified experimental diets containing 0.2% Ca from Ca-lactate (diet 1), no supplemental Ca (diet 2) and 0.2% and 2.5% Ca from tricalcium phosphate, TCP (diets 3 and 4), respectively. After a 10 week rearing period, growth and feed utilization were significantly lower in the fish group fed on diet 2 than in the fish group fed on diet 1. Fish groups fed on diets 3 and 4 also showed poor growth performances compared with group 1. It appears that Ca intake from seawater is not sufficient for the normal growth of tiger puffer. Furthermore, Ca in dietary TCP appeared to be unavailable to this species. Dietary TCP strongly inhibited the bone mineralization of Zn and Mn. The findings indicate that easily digestible Ca supplementation is indispensable in a diet of tiger puffer for normal growth, feed utilization and bone mineralization. © Rapid Science Ltd. 1998     

Essentiality of dietary calcium supplement in redlip mullet Liza haematocheila

This study was conducted to determine the essentiality of dietary calcium supplement to redlip mullet Liza haematocheila . Juvenile fish were fed four purified experimental diets containing 2.0 g kg^–1 Ca from calcium lactate (diet 1), no supplemental Ca (diet 2), and 2.0 g and 25.0 g kg^–1 Ca from tricalcium phosphate (TCP, diets 3 and 4), respectively. At the end of the 10-week experiment, growth was significantly lower in fish fed diet 2 than fish fed all other diets. This suggests that redlip mullet do not obtain adequate Ca from sea water. Fish fed diets 3 and 4 showed growth performances similar to fish fed diet 1. However, dietary TCP negatively affected bone mineralization of Zn, Mn, K and Fe. The Ca, Zn and Fe levels in liver were low in fish fed TCP-supplemented diets. From these findings, it may be concluded that a dietary Ca supplement is necessary for redlip mullet. Although this species can use dietary TCP as a Ca source for growth, an easily digestible Ca (monobasic or dibasic) supplement to a TCP-rich diet is also essential to maintain normal mineral levels in tissues.     

暗纹东方鲀非01霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测

在对养殖暗纹东方病害调查中，从呈典型症状病鱼腹腔和肠道粘液中分离到2株（J-1和H-3）菌株，经生化特性和血清型鉴定为非01群霍乱弧菌(Non-01 Vibrio cholerae)。注射、创伤和浸泡3种方式进行人工感染试验表现出较强的致病性，出现症状与自然发病鱼相同。为进一步确认分离菌株的分类地位，使用P1、P2引物，以非01群霍乱弧菌N92001菌株和01群霍乱弧菌N16961菌株为对照，对分离菌株进行PCR扩增，得到451bp的DNA片段。根据现有霍乱弧菌肠毒素ctxA基因序列设计引物P3,P4，以N16961菌株为阳性对照，PCR扩增结果均得到大小为400 bp的DNA片段。在对H-3菌株的扩增片段进行纯化、克隆和测序，得到407bp序列，该菌株与N16961菌株中肠毒素ctxA基因序列的完全一致，证实该片段源于ctxA基因。进一步说明从暗纹东方体内分离到的J-1和H-3菌株具有霍乱肠毒素ctxA，有一定的致病力。     

盐酸恩诺沙星与其他四种抗菌药物对水产致病菌的体外抗菌作用

用琼脂平板稀释法测定了盐酸恩诺沙星、盐酸环丙沙星、氟哌酸、米诺沙星和氟苯尼考对常见水产致病菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，结果表明：同一抗菌药物对不同致病菌的抗菌效果存在较大差异，不同抗菌药物对同一致病菌的抗菌效果也存在较大差异。使用4倍MBC的药物浓度对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和非O1-群霍乱弧菌杀菌时间随药物种类和致病菌不同而存在差异。     

致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测

从山东沿海的发病鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到1株致病性哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1．4kb的特异性片段。DNA序列分析表明，该克隆片段含有完整的1254bp溶血素基因，该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99．0％和98．5％；与副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）热稳定性溶血素基因（TDH）的相似性为74．5％；与拟态弧菌（V．mimicus）、创伤弧菌（V．vulnificus）、霍乱弧菌（V．chderae）磷脂酶基因的序列相似性分别为57．4％、59．2％、53．0％；与最小弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、霍氏弧菌（V．hollisae）、河流弧菌（V．tguvialis）、鳗弧菌（V．anguillarum）的溶血素基因的相似性仅为19．9％～24．8％。根据溶血素基因的保守区段，设计了1对特异引物。分析表明，该引物能特异检测哈维氏弧菌。其可检测的DNA最小量为0．001ng。用该方法对55株不同来源的患病鱼分离的疑似病原菌进行检测，结果检出8株哈维氏弧菌，检出率为14．55％，从健康动物中检出数占所检弧菌数的6．25％，海洋环境为10．53％，海水养殖环境为26．53％，表明哈维氏弧菌在不同的海水环境及健康海洋动物中普遍存在，在养殖水体中的数量高于其他海水环境。     

海洋蛭弧菌LBd02-1的分离及其生物学特性的研究

利用海水双层平板法分离获得蛭弧菌LBd02-1,从基因水平上进行鉴定,并对其生物学特性进行了初步研究。研究结果表明,蛭弧菌LBd02-1对嗜水气单胞菌、鳗弧菌、大肠杆菌和霍乱弧菌等革兰氏阴性菌有较好的裂解作用;对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌的裂解能力较弱。以鳗弧菌为宿主菌,探索了不同条件(温度、盐度、Ca2+、Mg2+)下蛭弧菌LBd02-1对鳗弧菌的裂解效果。试验结果表明,蛭弧菌LBd02-1在温度为25~30℃.盐度为10~30时,对鳗弧菌的裂解效果较佳;在Ca2+浓度为5~10 mmol/L、Mg2+浓度为0.5~2 mmol/L时,蛭弧菌LBd02-1的裂解能力也较好。     

A comparative study on innate immunity parameters in the epidermal mucus of Indian major carps

The innate immune system, particularly the external body surface, plays a frontier role in protecting fish from relevant infections. The present study is aimed at understanding and comparing the mucosal immunity of Indian major carp, that is, Labeo rohita, Catla catla and Cirrhinus mrigala, by evaluating different immune parameters such as protein content, lysozyme, myeloperoxidase, proteases and alkaline phosphatase activity in the skin mucus. The protein content of mucus sample of these species was compared, and the highest protein content was found in C. catla among the three Indian major carp species. The levels of proteases (40 ± 0.211 units/ml) and myeloperoxidase OD450 nm (1.525 ± 0.108) were found to be highest in the skin mucus of C. catla. However, lysozyme levels were highest in the skin mucus of L. rohita (10.95 ± 0.330 μg/ml), and C. mrigala had the highest alkaline phosphatase activity (30.74111 ± 0.680 U/l). Besides the enzyme activities, the epidermal mucus samples of three Indian major carp species were also tested and compared for the antibacterial activity against seven bacterial strains. Skin mucus of C. catla showed highest antibacterial activity among the three Indian major carps against all the seven bacterial strain, except that Micrococcus lysodeikticus and Vibrio cholerae, however, showed highest activity against mucus of C. mrigala. Also, the epidermal mucus from all the three species successfully agglutinated three freshwater pathogens, viz. Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescens and Edwardsiella tarda, with agglutination titres being the highest for Labeo rohita for all the pathogens. The epidermal mucus samples from the Indian major carp species showed haemagglutination activity and successfully lysed human, chicken and goat RBCs showing highest activity in C. catla. These results provide information for a better understanding of the role of epidermal mucus and its components in the innate immune system of Indian major carps.     

流水式养殖动物中弧菌和嗜水气单胞菌的PCR法监测

为了解流水式养殖场养殖动物中弧菌和气单胞菌的感染状况,分别针对霍乱孤菌肠毒素A亚单位(ctxA)基因、0139和01群群特异基因、毒力协同调节菌毛A亚单位基因(tcpA)、中心调节蛋白基因(toxR)、副溶血弧菌不耐热溶血素基因(tlh)、创伤弧菌Vibrio vulnificus溶细胞素基因(vvhA)和嗜水气单胞菌的气溶素基因(aerA)设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)检测技术,PCR产物经电泳,根据扩增条带的大小和数目,检测和区分霍乱孤菌、嗜水气单胞菌和副溶血孤菌.对南昌沿岸霍乱流行水域及附近养殖场的养殖动物进行了18个月的连续监测,对1 440份水产品的增菌液进行PCR检测,17份检出副溶血弧菌,25份检出霍乱弧菌,创伤弧菌和嗜水气单胞菌均未检出.扩增结果与传统培养检测法的结果一致.监测结果表明,南昌附近地区霍乱弧菌和副溶血弧菌检出率分别为1.74%和1.18%,总体感染状况处于较低水平,但个别养殖品种弧菌检出率较高.