坛紫菜叶状体RNA提取方法的改良与比较

为提取高质量的坛紫菜叶状体总RNA,对常用的几种植物RNA提取方法(CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法)按照去除多糖、多酚的方法进行了改良,并对分离的总RNA根据吸光值、电泳图谱及RT-PCR检测等结果与两种试剂盒(离心柱试剂盒法,RNAiso法)的提取结果进行了比较。结果表明,SDS法、异硫氰酸胍法和RNAiso法3种方法提取的RNA纯度低,质量差,部分RNA已经发生了降解。而改良CTAB法和离心柱试剂盒法提取的总RNA质量可靠,完整性好,纯度高,并且成功去除了可能影响逆转录酶活性的物质,可以进一步应用于cDNA文库构建,基因表达分析等后续实验,但这两种方法各有优缺点,应根据实际情况选用合适方法进行坛紫菜叶状体总RNA的分离。     

刺参体内RNA干扰方法的初步研究

以刺参溶菌酶基因(lysozyme gene,LYZ)为靶基因探索构建刺参体内RNA干扰体系。构建了3个刺参溶菌酶基因特异性的RNA干扰重组质粒,以刺参体腔液原代培养细胞为靶细胞进行筛选;分别以口腔注射和腹腔注射的方式以及不同的注射剂量对刺参LYZ进行体内RNA干扰,并运用qPCR技术测定刺参LYZ的表达量;最后,对刺参LYZ进行体内RNA干扰,并分别运用qPCR技术和比浊法测定刺参LYZ的表达量及其酶活性。结果显示:3种RNA干扰重组质粒的沉默效率分别为40%、45%、0%;体腔注射RNA干扰重组质粒时,各组织中LYZ的表达量均出现了显著的上升(P0.05),而从口腔注射时,体腔液和肌肉中LYZ的表达量均出现极为显著的下降(P0.01),而在管足中未出现明显变化;当其注射剂量为0.5μg和5μg时未对LYZ的表达产生有效的抑制作用;当注射剂量为10μg和25μg时,刺参体内LYZ的表达受到了明显抑制,但是注射剂量为25μg时,部分刺参个体出现吐肠现象;在转染12h后,刺参体腔液、肌肉、体壁、疣足和管足组织中LYZ的表达量开始下降,到第四天后开始回升。表明:只有从口腔注射RNA干扰重组质粒且注射剂量达到10μg时才能有效地抑制靶基因的表达;刺参体内RNA干扰具有系统性,可以在各个组织间相互传导。     

长江华溪蟹组织RNA提取的研究

比较了长江华溪蟹Sinopotamon yangtsekiense心脏、肝胰腺、鳃和性腺等组织中提取总RNA的4种方法,同时比较了同一方法提取不同组织RNA的质量,总结出适合于蟹类组织RNA提取的方法.结果表明,TRIzol法提取效果最好,心脏总RNA质量最高.此外,实验中提取的总RNA污染少、完整性好,为以后进行cDNA合成、基因表达及定量分析等研究奠定了基础.     

刺参肠组织蛋白质双向电泳体系的建立及优化

以刺参肠组织为材料,通过蛋白质提取方法、上样前处理方法、上样量以及聚焦条件的优化,建立了刺参肠组织蛋白质双向电泳技术体系.试验结果表明,采用TCA-丙酮沉淀法制备刺参肠组织蛋白质,能够得到高纯度的蛋白质提取液.刺参样品上样前不经过处理,等电聚焦电压1 000V,电流7mA,聚焦时间3h,平衡时间30min,最佳上样量25μg,pH 4～6.5、8.5cm的IPG胶条,银染能获得较好的双向电泳图谱.通过蛋白质双向电泳体系的优化,获得了刺参肠组织的蛋白质表达图谱,为进一步研究刺参差异表达蛋白的筛选及蛋白质组学研究提供技术保障     

装甲RNA在牡蛎中诺如病毒4种RNA提取方法比较研究中的应用

RNA提取是诺如病毒检测的关键步骤,而目前贝类中诺如病毒RNA提取、检测方法的比较与评价常囿于缺乏量值明确、无生物安全隐患的标准样品作为参考依据。本研究将前期制备的 GⅡ型诺如病毒装甲RNA (3.0×1010拷贝)作为标准样品,人工污染牡蛎(Ostrea gigas tnunb)消化腺匀浆物,用4种常见RNA提取方法：TRIzol试剂、Viral RNA Kit、High Pure Viral Nucleic Acid Kit、柱式病毒RNAOUT试剂盒,分别提取RNA,经实时荧光RT-PCR检测后,利用标准曲线进行定量分析,分别计算4种方法对装甲RNA的回收率。结果显示,对于匀浆样本,TRIzol法对装甲RNA的回收率最高(6.80±0.89)%,显著高于Viral RNA Kit (4.51±2.28)%,二者的回收率又显著高于High Pure Viral Nucleic Acid Kit (0.24±0.05)%与柱式病毒RNAOUT试剂盒(0.11±0.02)% (P?0.05);对于冻干样本,Viral RNA Kit对装甲RNA的回收率最高(8.71±0.17)%,显著高于TRIzol试剂(7.12±0.64)%,二者的回收率又显著高于High Pure Viral Nucleic Acid Kit (0.33±0.12)%与柱式病毒RNAOUT试剂盒(0.06±0.01)% (P?0.05)。研究表明,TRIzol试剂与Viral RNA Kit对牡蛎消化腺样本中人工添加的装甲RNA均有良好的回收效果,同时也提示装甲RNA可作为一种良好的标准样品用于不同RNA提取试剂盒方法的评价与比较研究。     

黄河鲶不同组织中RNA提取纯化方法研究

从组织提取RNA的完整性对于分子生物学研究是至关重要的。RNA提取方法有多种。采取异硫氰酸胍法从黄河鲶肌肉、血液、全鱼、肾脏、肝脏、卵巢中提取出完整RNA,结果表明,通过该方法所提取RNA质量高,效果好,可以用于进一步的分子生物学研究。     

大连刺参体腔液甘露糖结合凝集素序列的鉴定及分析

根据NCBI提交的刺参体腔液(Apostichopus japonicus)甘露糖结合凝集素(Mannan-binding lectins,MBLs)序列(AY625513)设计引物,抽取刺参体腔液进行总RNA提取,采用RT-PCR技术,获得498 bp目的片段。通过克隆、测序确定得到刺参MBLs序列。将得到序列进行核苷酸和氨基酸序列比对,鉴定了大连刺参MBLs序列,并为我国不同区域刺参的进一步分类提供了科学的分子水平依据。     

草鱼成熟脂肪细胞总RNA提取方法研究

获得高质量的RNA是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern blot以及转录组测序(RNA-Seq)等分子生物学研究的基础,由于草鱼脂肪细胞中油脂含量较高,从中提取高质量RNA存在困难。本研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成熟脂肪细胞为材料,通过增加离心和抽提次数等方式对传统总RNA提取方法进行优化,采用琼脂糖凝胶电泳、核酸定量分析及基因扩增等方法验证所得RNA的完整性、纯度及质量。结果表明,经此方法提取的草鱼成熟脂肪细胞总RNA的A260 nm/A280 nm比值在1.95到2.00之间,28S和18S条带完整,草鱼LPL和β-actin基因扩增条带清晰。认为采用本方法获得的草鱼脂肪细胞RNA样品质量较高,能够用于后续分子生物学研究。     

锦鲤保护性组织RNA提取及引物扩增研究

从养殖锦鲤各种组织中提取完整的RNA, 是分子生物学研究锦鲤应激表达、体色变异、生长发育等功能基因表达的关键实验。在不伤害养殖锦鲤个体健康的情况下, 取用鱼体的鳍条、鳞片、鳃丝、血液4种保护性组织,可以最大程度地减少对珍贵锦鲤个体的损伤, 并达到研究相关基因表达的目的。本研究利用TR izo l法提取RNA, 获得的各样品RNA条带完整、纯度高。结果表明, 4 种保护性组织提取的RNA 经过逆转录反应, 得到了高质量的CDNA。内标基因( B- actin)、热激蛋白基因( hsp70)、金属硫蛋白基因(MT)扩增得到清晰的条带, 通过NCB I数据上的BLAST比对证明, 各序列的同源性在95%以上。利用本研究的方法, 可以充分保护养殖锦鲤个体的完好性, 用于进一步的分子生物学研究。     

锦鲤保护性组织RNA提取及引物扩增研究

从养殖锦鲤各种组织中提取完整的RNA,是分子生物学研究锦鲤应激表达、体色变异、生长发育等功能基因表达的关键实验.在不伤害养殖锦鲤个体健康的情况下,取用鱼体的鳍条、鳞片、鳃丝、血液4种保护性组织,可以最大程度地减少对珍贵锦鲤个体的损伤,并达到研究相关基因表达的目的.本研究利用TRizol法提取RNA,获得的各样品RNA条带完整、纯度高.结果表明,4种保护性组织提取的RNA经过逆转录反应,得到了高质量的CDNA.内标基因(β-actin)、热激蛋白基因(hsp 70)、金属硫蛋白基因(MT)扩增得到清晰的条带,通过NCBI数据上的BLAST比对证明,各序列的同源性在95%以上.利用本研究的方法,可以充分保护养殖锦鲤个体的完好性,用于进一步的分子生物学研究.     

老化参池刺参腐皮综合征致病原的分离与鉴定

从患病刺参体表病灶组织分离出菌株060330B,其优势度高达90%,人工回接感染试验证实其具有较强的致病性,可导致健康刺参出现与自然患病刺参相同的症状。通过形态学观察、API半自动化鉴定和常规生理生化试验的结果表明,菌株060330B具有假单胞菌属的特征,其表型特征与恶臭假单胞菌相似。对该菌株进行16SrRNA基因序列分析和构建系统发育树,结果显示其与恶臭假单胞菌的亲缘关系最近,相似率达到99.5%。菌株060330B可鉴定为恶臭假单胞菌,并视为养殖刺参腐皮综合征的致病原之一。通过对多起不同来源患病刺参的研究表明,使用年限长、淤泥层厚呈黑色并伴有腥味的养殖池塘在该时期容易导致刺参腐皮综合征的发生。     

灵山岛浅海岩礁区刺参增殖放流研究

１９９１－１９９２年在灵山岛西侧海区进行了刺参增殖放流试验。结果表明，笼播参苗在自然海区比较安全，参苗存活率为１０％左右。撒播参苗因短期内较骓适应自然海况，易被海流带走等多种因素，参苗存活率甚低。     

刺参南方池塘吊养技术研究

利用7万只2~3cm的刺参在福建省莆田市开展了池塘吊养试验。经150d培养,成活率达92%,平均体长为12.0cm(108g/只),最大个体达15.6cm。总结出一套池塘吊养、冬季南方越冬的刺参养殖技术,为南方冬季海水增添新的养殖品种。     

底管微孔增氧技术对参池环境及刺参生长的影响试验

对黄河三角洲地区底管微孔增氧机在刺参养殖池塘中的应用进行了试验,对底管微孔增氧技术对参池环境和刺参生长的影响进行了研究。结果表明,在参池中合理使用底管微孔增氧机可显著增加参池溶氧,并显著提高刺参重量,是一种值得推广的新型增氧技术。     

刺参与日本对虾池塘高效混养技术

刺参夏眠期间正是日本对虾生长的大好季节,将刺参和日本对虾混养,在7月份放养虾苗,严格控制养殖池内的杂鱼虾等,就可大大提高日本对虾和刺参的成活率,利用此二者在饵料和空间的互补性,可显著提高虾池的利用率和经济效益。     

黄河口刺参苗种的盐度适宜性研究

通过设置不同的盐度梯度(20‰,25‰,30‰,35‰),对黄河三角洲地区养殖的刺参稚参在不同盐度下的生长状况进行了研究。结果表明,黄河三角洲地区刺参生长最适盐度范围在25‰~30‰。过高或过低的盐度对刺参生长产生影响的原因可能是:第一,在呼吸树的作用下,耗氧率增加以调节渗透压,消耗了能量,影响了刺参的生长;第二,刺参体内环境的改变影响了消化酶活性,进而影响刺参的摄食和消化。     

刺参一种囊膜病毒的分离及其超微结构观察

利用电镜负染技术检测发病的养殖刺参[Apostichopus japonicus（Selenka）]组织提取液。观察发现，提取液中存在大量病毒样粒子，该病毒粒子近似球形，具有囊膜。囊膜内可见高电子密度的核心结构。完整的病毒粒子直径为80～100nm，囊膜厚6～10nm，核心结构直径35-45nm，呈六边形。应用超薄切片技术对刺参的触手顶部、触手臂、疣足、呼吸树、背肠血管、肠等组织的病毒感染状况进行观察，发现该种病毒粒子大量存在于所检测各组织内。感染细胞超微结构表现为大量细胞器崩解形成空泡结构，并出现“髓袢样”结构等病理变化。根据观测结果，该病毒是一种无包涵体病毒。     

4种海参16SrRNA和COI基因片段序列比较及系统学研究

采用PCR技术对来自山东荣成、长岛、俄罗斯和日本的刺参(Apostichopus japonicus),来自澳大利亚的黄乳海参(Holothuria fuscogilva),来自冰岛的北大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)和来自福建的二色桌片参(Mensamaria interce-dens)的16SrRNA和COI基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度约为500bp和540bp的片段。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数进行基因序列变异分析。结果表明,根据16SrRNA、COI基因片段进行刺参种内差异比较时,长岛和荣成刺参序列差异最小,和日本刺参序列差异最大;刺参和其他科3种海参种间的序列差异远远高于刺参种内差异。从GenBank中选取7条海参序列与本研究所测序列一同构建了NJ和ME系统树。根据2种基因片段的系统学分析均表明,刺参属和拟刺参属亲缘关系很近,可能有共同的起源。而海参科未与同属于楯手目(Aspidochirolida)的刺参科聚类,而与枝手目瓜参科和沙子鸡科聚为一支,与形态学的分类不一致。     

仿刺参自然群体和养殖群体间遗传变异的微卫星标记研究

应用微卫星DNA技术对仿刺参自然群体和养殖群体遗传多样性进行了研究。在经过筛选的9个座位中,每个座位检测到的等位基因数为4～12个。自然和养殖群体中,有效等位基因平均数分别为6.5556和5.8889,观测杂合度的平均值分别为0.6416和0.5635。根据群体中各座位等位基因频率计算出两群体间的遗传相似度为0.7970、遗传距离为0.2269。对两群体进行Hardy-Weinberg平衡检验发现,两群体在某些位点都出现了杂合子缺失现象,特别是养殖群体在位点Psj2022,其Hardy-weinberg遗传偏离指数达0.5164。结果表明,与自然群体相比,仿刺参养殖群体存在杂合度降低,遗传多样性下降的现象,这可能与人工养殖过程中,亲本群体较小,引起近交机会增加有关。应制定相应的渔业生产和管理措施加以保护,以使仿刺参养殖持续健康发展。