Construction of Tobacco Bax Inhibitor-1 ihpRNA Gene Silencing Vector and Transformation into Agrobacterium tumefaciens EHA105

The plasmid pGSA1285 was first modified by substituting its GUS sequence with the Chalcone synthase intron fragment from vector pFGC5941 to get the plant silencing expression vector that contained Kanamycin resistance site and was named as pGSA2285. Using PCR-based amplification, two different restriction sites at both ends of tobacco Bax inhibitor-1 (NtBI-1) gene were created, respectively, which made the construction of ihpRNA gene silencing vector more efficiently. Then, NtBI-1 genes were inserted into M...     

烟草Bex inhibitor-1基因植物沉默表达载体的构建及对农杆菌的转化

试验首先对质粒pGSA1285进行改造,将pFGC5941质粒的查尔酮合酶的Intron片段取代pGSA1285的GUS片段,构建含有内含子并具有卡那抗性的pGSA2285植物沉默表达载体。同时设计引物、PCR扩增、在BI-1基因两端各加上两个酶切位点,将BI-1基因分别反向、正向插入改造后的质粒pGSA2285Intron片段两端的多克隆位点中,构建得到烟草BI-1基因沉默载体pGSA4285。此沉默质粒经PCR鉴定、限制性酶切分析以及回复动员试验证明已正确构建并成功转入农杆菌,为获得含有BI-1基因沉默烟草植株及其在植物程序性死亡中调控作用的研究奠定试验基础。     

南瓜蚜传黄化病毒P0蛋白基因ihpRNA载体构建及烟草转化

P0蛋白是南瓜蚜传黄化病毒基因组编码的基因沉默抑制子。根据已克隆的CABYV P0蛋白基因序列,设计带酶切位点的特异性引物,PCR扩增用于构建RNAi表达载体的P0蛋白基因正反义片段。将正反义片段分别插入到含有内含子的中间载体pBSint上,得到重组的中间载体pBSint-P0-F-R。用Sal I和Sac I双酶切pBSint-P0-F-R,将切下的包括内含子和正反义P0蛋白基因在内的片段定向克隆到植物表达载体pCambia1300上,得到含有发卡结构的RNAi表达载体pCambia-P0-F-R。通过农杆菌介导的方法将该表达载体转化本生烟,经PCR检测,得到4株阳性转基因植株。为设计出更广谱、特异有效的抗病毒策略及研究病毒蛋白的功能特性及其侵染机制提供实验材料。     

靶基因Bi-1RNAi重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建靶向人Bax Inhibitor-1（Bi-1）基因的shRNA慢病毒重组载体。方法借助siRNA设计工具,并结合文献资料选取Bi-1基因编码序列中有效的干扰靶点,根据连接载体中的酶切位点自行设计并人工合成干扰靶点的一对反义脱氧寡核苷酸链,先定向克隆到pU6载体（pU6-Bi-1-shRNA）,再经双酶切后克隆到慢病毒包装质粒LunIG,得到靶向Bi-1基因沉默的慢病毒包装重组质粒LunIG-Bi-1。重组质粒经PCR法进行初筛后,再通过双酶切电泳和目的基因沉默效果的检测保证插入序列的正确性。结果靶向沉默Bi-1基因的shRNA序列成功插入到慢病毒包装质粒LunIG中。结论靶向Bi-1基因沉默的慢病毒shRNA包装重组质粒构建成功。     

可用于植物转化的RNAi载体构建方法

利用PCR方法扩增杨树Poptr;CYCD1;1基因的一段内含子序列,并克隆到pROKⅡ载体中,以构建可用于植物特定基因表达干扰的RNAi载体。为了验证载体的效果,构建pCAMBIA-1303载体转化烟草,经检测,转基因烟草能过量表达外源GUS与GFP融合蛋白。把GUS及GFP片段序列连接于RNAi载体,并导入pCAMBIA-1303载体转化烟草。试验结果表明,GUS及GFP干扰序列的导入均能大大降低外源GUS与GFP融合基因的表达。结果说明构建的载体能有效干扰特定基因的表达。     

dsRNA介导的抗ToMV和CMV植物表达载体的构建

[目的]构建通过表达dsRNA,诱导植物基因沉默机制可抗2种病毒的表达载体.[方法]根据已报道番茄花叶病毒(ToMV)的运动蛋白基因(MP)和黄瓜花叶病毒(CMV)的沉默抑制子基因(2b)的核苷酸序列设计特异性引物,扩增到部分△MP和2b基因;然后通过重组PCR技术将2个病毒基因进行融合,获得长度为676 bp的融合基因△MP-2b.再将融合基因以反向重复的方式与大豆内含子相连,并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游.[结果]构建了含两种不同病毒来源基因的植物表达载体pBIN438△MP-2b(i/r).酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致.[结论]为利用RNA沉默原理进行植物广谱抗病研究奠定了基础.     

高羊茅春化基因RNAi表达载体的构建

[目的]用RNAi干扰技术沉默高羊茅FaVRN1。[方法]将拟南芥内肌动蛋白含子（145bp）插入到表达载体pBI121已构建能形成发夹的中间载体。设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增高羊茅春化基因351bp长的外显子靶标序列,限制性酶切后以正向和反向插入到RNA干扰中间载体内含子两端,构建带发夹结构的RNA干扰表达载体。[结果]双酶切结果表明内含子（145bp）已成功连入表达载体。PCR和酶切验证证实目的基因（351bp）已连入中间表达载体。[结论]该研究为培育RNAi转基因开花抑制型高羊茅新品种奠定基础。     

笋瓜韧皮部特异性启动子的克隆分析及新型植物表达载体构建

根据已报道具韧皮部组织特异性的笋瓜韧皮部蛋白2（PP2）基因序列设计引物,以山西本地种笋瓜叶片基因组DNA为模板,用PCR法扩增得到了长度为966bp的PP2基因启动子片段,克隆入pUCm—T载体后,经鉴定获得了新的重组质粒pUCm—PSP,测序和序列分析表明与两个已报道的片段分别有95％和99％的同源性,推测具有相似的启动子功能。分别用限制性内切酶PstⅠ和BglfⅡ双酶切重组质粒pUCm—PSP和由CaMV35S组成型启动子驱动GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1302,分别回收pUCm—PSP重组质粒中的PSP小片段和pCAMBIA1302植物表达载体中去掉GFP报告基因上游CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动报告基因GFP的新型植物表达载体pHZ03。利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中,为进一步研究其表达功能奠定了基础。     

马铃薯 StBI-1 基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Bax inhibitor 1(BI-1）是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为 StBI-1 ;蛋白结构预测分析表明, StBI-1 包含7个跨膜域和Bax inhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析 StBI-1 基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能。结果显示, StBI-1 响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达 StBI-1 可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯 BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。     

种番鸭减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的克隆与序列分析

运用PCR技术从表现产蛋异常的种番鸭分离鉴定的减蛋综合征病毒(EDSV)E05株中分段扩增六邻体蛋白基因,分别与克隆载体pMD18-T连接后,转化感受态细胞,对经PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的克隆进行测序.结果表明,E05株六邻体蛋白基因长度为2733 bp,共编码910个氨基酸.序列分析表明,该株病毒与鸡源EDSV 127株和鹌鹑源EDSV QU株六邻体蛋白基因的核苷酸同源性分别为99.6%和96.0%,氨基酸同源性分别为99.9%和99.3%.     

新城疫病毒F和HN基因真核表达载体的构建

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F、HN基因序列和真核细胞表达载体pEGPF-N1的克隆位点,分别设计一对引物,通过PCR方法获得了F、HN基因,经回收纯化,将产物连接到克隆载体pMD18-T上。酶切鉴定和序列分析后,再将目的基因亚克隆到真核细胞表达载体pEGPF-N1上,经鉴定,成功构建含有NDVF和HN基因的真核细胞表达载体pEGPF-N1-F和pEGPF-N1-HN,为下一步研究NDVF和HN蛋白在细胞凋亡中的生物学功能奠定基础。     

干扰隐花色素Cry1a与Cry1b基因的表达对水稻若干农艺性状的影响

利用已公布的水稻Cry1a与Cry1b基因序列设计引物,PCR扩增基因部分片段,构建了一个包含2个隐花色素基因片段的ihpRNA表达载体pSC1301-347-Cry1aCry1b,并通过农杆菌介导转化水稻,以期同时导致这2个基因功能缺失.根据转基因植株主要农艺性状的表现,初步分析了Cry1a与Cry1b对水稻重要农艺性状的影响.结果表明,转基因水稻开花期推迟16 d,株高增加明显,粒型显著变长,而其他所观察的性状无明显改变.     

棉花蔗糖合成酶3基因第1个内含子在基因表达中的作用

为了研究棉花SUS3基因编码区的第1个内含子在基因表达调控中的作用,分离该内含子并将其插入到GUS基因编码区中构建载体Susfig::121,将载体Susfig::121通过农杆菌介导转入拟南芥.对转基因拟南芥进行GUS活性分析,发现该内含子对GUS基因在拟南芥中的表达具有负调控作用,并且特异抑制报告基因在花粉中表达....     

陆地棉两个GhBI-1基因的生物信息学分析

BI-1基因是广泛存在于真核生物、原核生物和病毒中的一个保守性基因,具有抑制细胞凋亡的作用。本研究对克隆到的两个陆地棉BI-1基因——GhBI-1a和GhBI-1b进行生物信息学分析,发现其与拟南芥BI-1有很高的同源性,尤其羧基尾极为相似。GhBI-1a有6个跨膜区域,GhBI-1b有7个跨膜区域,它们的二级结构也与其他物种的BI-1相似,跨膜区域基本都是α螺旋。     

中国荷斯坦奶牛乳脂中miR-2285f生物信息学分析及靶基因验证

旨为探索bta-miR-2285f和宿主基因TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)的生物学功能,以及bta-miR-2285f与靶基因互作调节奶牛乳脂代谢的潜在机制,本研究通过生物信息学方法分析bta-miR-2285f在不同物种间的保守性,并通过上游序列CPG岛分析、启动子预测、进一步进行组织表达谱分析,预测靶基因并进行GO功能和KEGG通路富集分析。利用双荧光素酶报告试验验证bta-miR-2285f调控的下游靶基因钙结合蛋白39(Calcium binding protein 39,CAB39),并在乳腺上皮细胞水平探究bta-miR-2285f的功能作用。结果表明：1)bta-miR-2285f是牛特异性miRNA,属于内含子miRNA;2)bta-miR-2285f与宿主基因TBK1上游序列2 kb处均不含有CPG岛。bta-miR-2285f在上游586 bp处为转录起始位点。宿主基因TBK1在上游105 bp处为转录起始位点;3)TargetScan和miRWalk预测miR-2285f有172个交集靶基因,主要参与新陈代谢、遗传信息传...     

条斑紫菜TPS基因TPP结构域的缺失突变

条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)基因(PyTPS)具有TPS及TPP双结构域,以该基因的原核表达载体pET22b-PyTPS为材料,利用双酶切片段替换法对该基因TPP结构域磷酸酶基序的编码框Box1与Box2进行了缺失突变.第一,用715bp缺失Box1的KpnI-EcoRI人工合成片段替换pET22b-PyTPS中相应的片段,获得了缺失Box1的突变基因PyTPS-Box1.第二,用661bp缺失Box2的EcoRI-HindII片段进行替换,获得了缺失Box2的突变基因PyTPS-Box2.第三,在缺失Box1后,再通过替换缺失Box2,获得了同时缺失Box1与Box2的突变基因PyTPS-Box1-Box2.本研究既获得了三种突变基因,又获得了其原核表达载体,为研究PyTPS基因的编码活性提供了材料,奠定了基础.     

小麦LKR/SDH基因RNAi载体构建与遗传转化

小麦是世界主要粮食作物之一,但籽粒赖氨酸含量低,影响其营养品质。为了通过生物技术提高小麦籽粒中赖氨酸含量,选用小麦LKR-SDH基因靠近3'端385 bp的保守序列,以水稻pGluB为启动子,拟南芥FAD2第一内含子为间隔序列,pUC18为中间栽体,构建LKR-SDH基因的hpRNA表达盒。然后将hpRNA表达盒插入到pAHC25的HindⅢ酶切位点上,成功构建小麦LKR-SDH基因RNAi植物表达载体pAHC25-TaLKR/SDH-RNAi。通过限制性内切酶酶切鉴定,表明pAHC25-TaLKR/SDH-RNAi载体构建正确。进一步采用基因枪法将其转入到扬麦158中,获得了部分小麦转化植株。旨在为小麦高赖氨酸品种的培育提供候选材料。     

适于烟草脆裂病毒诱导的本氏烟基因沉默分析的对照载体构建(英文)

对烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默分析体系中目前最常用的对照载体——空pYL156载体(pYL156∷00)对沉默处理后番茄和本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株的病毒症状和生长影响进行分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的番茄和本氏烟植株均表现出严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,因此,pYL156∷00并不是一个用于TRV诱导的番茄和本氏烟基因沉默分析的好的对照载体;为获得更好的对照载体,试验构建了2个新的对照载体pYL156∷NIRi和pYL156∷eGFP,它们分别通过在pYL156∷00载体多克隆位点插入253bp菜豆亚硝酸还原酶基因内含子序列和400bp eGFP基因片段而获得,对这2个对照载体对沉默处理后本氏烟植株的病毒症状和生长情况的影响与pYL156∷00进行比较分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的植株表现出较严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,其中26.7%植株死亡;pYL156∷NIRi沉默处理后的植株也表现出明显的病毒症状以及生长受抑制现象,但与pYL156∷00相比,所受影响较小,只有13.3%植株死亡;而pYL156∷eGFP沉默处理后的植株不表现明显的病毒症状,植株生长也不受显著影响;病毒积累量检测结果显示,3个对照载体沉默处理的植株病毒症状和生长受抑制情况与植株体内TRV病毒的积累水平密切相关.这些结果表明,新构建的pYL156∷eGFP可以作为一个优越的对照载体应用于TRV诱导的基因沉默分析.     

人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达

将人乳铁蛋白基因与腺病毒基因组骨架质粒重组,在293细胞中包装重组腺病毒颗粒,获得真核细胞表达的栽体pAd-hLTF.以pcDNA3X为模板,PCR扩增hLTF基因,腺病毒穿梭栽体pshuttle-cmv与hLTF重组为pshuttle-cmv-hLTF:再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组为pAd-hLTF质粒:脂质体法将重组pAd-hLTF质粒转染HEK 293细胞.包装成重组腺病毒颗粒.Western blot和ELISA法测定细胞中hLTF基因的表达.结果表明,pAd-hLTT质粒转染293细胞后,7～10 d后,获得细胞裂解液,将细胞裂解产物再次接种新鲜的293细胞,3～5 d后,80%以上的细胞变圆、膨胀、漂浮.Westem blot和ELISA结果显示,上清液中有hLTF基因的表达,为重组人乳铁蛋白的体外表达及其功能分析奠定了基础.     

拯救新城疫病毒LaSota株辅助质粒的构建

本实验室保存的LaSota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的LaSota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒并酶切鉴定,鉴定正确的样品进行序列测定,并比对测序结果。结果证明测序结果与GeneBank上公布的LaSota株新城疫病毒序列完全一致,没有任何氨基酸和核苷酸的变化,将NP、P、L分别连接至pVAX载体,其中L1～L4为顺次连接。鉴定结果表明NP、P和L基因已正确克隆至pVAX表达载体,证明3个辅助质粒构建成功,分别命名为pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L。