籽粒硬度Pinb基因反义表达载体构建及遗传转化

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状.利用含有Ubi启动子、Bar表达盒的基础质粒pAHC25,构建了含有Pinb基因的植物反义表达载体pAHantipB,其中pAHantipB载有小麦籽粒硬度Pinb基因的反向序列,可用于小麦遗传转化,利用花粉管通道法将其转入软质小麦品种京411,获得1株转基因植株,T1代转基因植株抗性筛选及PCR12检测结果表明,转化率为0.17%.基因组DNA斑点杂交证实了外源基因在受体小麦基因组中的整合.     

转高赖氨酸含量基因(Cflr)小麦植株的获得及种子中蛋白质和赖氨酸的含量分析

为了获得种子总蛋白和赖氨酸含量都提高的转基因小麦新种质,构建了高赖氨酸蛋白基因(Cflr)的植物表达载体pAHC25-Cflr,用基因枪法将其导入扬麦158,通过PCR、RT-PCR和半定量PCR对转基因小麦植株T0及T1代进行了检测,同时对种子总蛋白含量与结合态系赖氨酸含量进行了测定和分析。检测结果表明外源基因已稳定整合到转化植株T0和T1代基因组中,并在小麦不同转基因株系的T1代中获得了表达,但不同株系的表达丰度不同。在检测的12株转基因株系中,有11个株系籽粒蛋白质的含量与其受体品种有显著差异,其中有6个株系的增幅在10%以上,最高的增加了22.6%;有10个株系种子干重的结合态赖氨酸含量有明显提高,8个株系与受体品种的差异达极显著水平,最高的Y1-2增幅达39.5%;从种子的蛋白质赖氨酸含量来看,有9个株系较受体品种有显著提高,其中4个株系与受体品种的差异达极显著水平,增幅最高的Y1-12蛋白质中赖氨酸含量比受体品种提高了22.9%。     

Pina和Pinb融合基因表达载体的构建及其在硬粒小麦中的转化

 【目的】构建Pina、Pinb融合基因表达载体，验证Pina和Pinb基因的功能，为利用转基因技术改良小麦籽粒质地提供理论依据和基础材料。【方法】以软质小麦京411作为Pina和Pinb基因的供体，将Pina、Pinb基因融合后，与基础质粒pG4AB上的Ω和poly(A)等增强基因表达的调控序列及pAHC25上的Ubiqutin启动子和bar基因表达盒相连接，构建Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体。利用基因枪转化硬粒小麦幼胚，并对硬粒小麦幼胚再生体系进行探索。【结果】在构建完成Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体pFUBPaPb的基础上，转化硬粒小麦幼胚16 000多枚，经biolaphos筛选、PCR鉴定和斑点杂交鉴定，得到再生植株2 390株，35株为阳性植株。共得到T1代籽粒356粒，对种子量较多的16个单株籽粒进行蛋白表达分析，有2株检测到基因表达产物，其籽粒SKCS硬度值比受体品种分别降低了10和12。培养基SD2适于硬粒小麦幼胚愈伤组织的诱导，MS+8 mg•L-1玉米素可获得较为理想的再生频率。【结论】Pina和Pinb的共同表达降低了硬粒小麦籽粒硬度，具有软化籽粒质地的功能。     

小麦TaLRK基因高效表达载体的构建及遗传转化

从抗白粉病小麦(Triticum aestivumL)品系99/2439中分离到1个类受体蛋白激酶基因TaLRK。为了研究TaLRK基因对小麦白粉病菌[Blumeria graminis(DC)E O Speer fsptriticiEm Marchal]的抗性作用,以单子叶植物高效表达载体pAHC25为基础载体,将TaLRK基因插入到玉米泛素高效启动子Ubi1的下游,构建成pAH-TaLRK( )植物高效表达载体。利用花粉管通道技术,以高产小麦新品种周麦18为受体进行了遗传转化。T0代植株经PPT抗性鉴定、PCR扩增检测,获得了19个转基因植株,为研究小麦TaLRK基因的功能奠定了基础。     

小麦WZY2基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

【目的】利用基因枪将WZY2基因RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri导入"郑引1号"小麦,获得WZY2基因表达缺失型小麦,为深入分析WZY2基因功能奠定基础。【方法】以植物表达载体pAHC25为基础,构建含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri,利用基因枪将其转入"郑引1号"小麦幼胚愈伤组织中,经过筛选、PCR检测得到阳性植株。【结果】从转化的1 500个愈伤组织中获得27株再生植株。利用PCR对再生植株进行检测,获得阳性植株3株,转化率为0.2%。【结论】构建了WZY2基因的RNA干扰表达载体,成功地将WZY2基因RNA干扰表达载体导入"郑引1号"小麦,获得阳性植株。     

甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建

[目的]克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础.[方法]通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA.扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用NotⅠ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体.[结果]通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5 ＇端UTR长度59 bp,3 ＇端UTR长度292 bp,开放阅读框（ORF）长度2895 bp,带有真核生物典型的poly（A）尾巴（GenBank登录号：HQ117935）.该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0％、98.9％和90.0％.构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri.[结论]成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础.     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG-基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK-/gI-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoRⅤ/StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRⅤ。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRⅤ,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。     

条锈菌诱导的小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区的克隆及原核表达

为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG,37℃诱导4 h。     

丝状真菌转化载体的改进

为了改进农杆菌介导丝状真菌遗传转化用的Ti双元载体,将质粒pUCATPH上真菌trpC基因启动子驱动的潮霉素B抗性基因(hygB)表达盒转移到Ti质粒pPZP111上,构建成用于丝状真菌遗传转化的Ti载体pATZ。将植物表达载体pDL916上的草丁膦抗性bar基因重组到载体pKS-trpC上,构建成含真菌启动子、终止子调控的bar基因表达盒的中间载体pTrpCBar;之后将该表达盒转移到pPZP111载体上,得到以bar基因为筛选标记的真菌转化Ti质粒pTBZ。上述质粒载体经酶切鉴定和DNA测序证实构建正确,为丝状真菌的农杆菌介导遗传转化提供了新的工具。     

ThIPK2基因植物表达载体的构建

为培育高度抗逆和无选择标记的转基因小麦,本研究从NCBI数据库中搜索到ThIPK2基因序列,依据该基因编码的氨基酸序列,参照小麦偏爱的密码子对该基因进行密码子优化,并将重复的和不必要的酶切位点去掉后进行人工合成。将改造后的ThIPK2基因插入到强启动子Ubiquitin和终止子AtSac66之间,然后将其插入到含有玉米Ac/Ds转座子背景骨架的植物表达载体中,获得了具有删除选择标记功能的、由玉米Ubiquitin启动子驱动ThIPK2基因的植物表达载体。经过限制性内切酶分析鉴定,该植物表达载体构建成功。     

高羊茅春化基因RNAi表达载体的构建

[目的]用RNAi干扰技术沉默高羊茅FaVRN1。[方法]将拟南芥内肌动蛋白含子（145bp）插入到表达载体pBI121已构建能形成发夹的中间载体。设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增高羊茅春化基因351bp长的外显子靶标序列,限制性酶切后以正向和反向插入到RNA干扰中间载体内含子两端,构建带发夹结构的RNA干扰表达载体。[结果]双酶切结果表明内含子（145bp）已成功连入表达载体。PCR和酶切验证证实目的基因（351bp）已连入中间表达载体。[结论]该研究为培育RNAi转基因开花抑制型高羊茅新品种奠定基础。     

柑橘衰退病毒基因RNAi载体的构建

基于转化病毒基因介导抗性,通过在植物表达载体p CAMBIA 2301上插入启动子–内含子–终止子的方式,构建一种含有发夹结构的、通用型强的RNAi载体骨架结构;以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)的p25、p20和p23基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段,先后与骨架载体连接,成功构建了3个RNAi载体(分别命名为ds2301–p25、ds2301–p20和ds2301–p23),并将载体ds2301–p23注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23基因的地高辛标记探针,用Northern杂交检测是否有si RNA产生。结果表明:用Northern杂交可以检测到p23特异的si RNA,在墨西哥莱蒙叶片中瞬时表达的农杆菌ds2301–p23可以发生RNAi,表达有效的si RNA。本研究中构建的骨架载体可以广泛用于RNAi载体的构建,含有柑橘衰退病毒基因片段的3个载体可以用于基因功能分析及具有CTV抗性的柑橘种质资源获得。     

玉米重要的转录因子Opaque2研究进展

Opaque 2蛋白是玉米中重要的转录激活因子,该基因的自然突变体o2会使玉米籽粒中赖氨酸含量大幅增加,文中综述了Opaque2基因的结构和该蛋白对玉米中醇溶蛋白基因、胞质丙酮酸磷酸双激酶(CyPPDK 1)基因、赖氨酸-酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氢酶(LKR/SDH)基因、b32基因等的调控作用,以及o2突变体在玉米育种研究中的应用。     

西农萨能羊FAS基因shRNA序列筛选及其腺病毒载体的构建

山羊脂肪酸合酶(Fatty acid synthase,FAS)是脂肪酸合成的关键酶,对乳腺短、中链脂肪酸合成起重要调控作用。设计了shRNA-5544、shRNA-5936s、hRNA-6132 3条针对FAS基因不同区域的小发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)及一条阴性对照序列shRNA-NC,并构建表达这4条shRNA序列的入门载体及其靶基因与红色荧光蛋白基因的融合表达载体,二者共转染HEK 293细胞进行有效序列筛选,结果显示shRNA-5544和shRNA-5936序列具有明显的干扰效果。在LR Clonase-Ⅱ重组酶作用下,分别将pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5544、pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5936及pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-NC入门载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST进行LR重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后成功获得3个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切鉴定及测序分析证实所构建的重组腺病毒载体中插入序列与设计序列一致。重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,利用Lipofectamine 2000转染HEK 293细胞,10~12 d后收集病毒,在HEK 293细胞中反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,利用TCID50法测定重组腺病毒滴度分别为6×108PFU/mL(表达shRNA-5544序列)、5×108PFU/mL(表达shRNA-5936序列)及6×108PFU/mL(表达shRNA-NC序列),为进一步在原代培养的山羊乳腺上皮细胞中进行FAS基因的RNA干扰研究奠定基础。     

乙烯应答因子W17基因RNAi表达载体的构建及小麦遗传转化

干旱、高盐和病虫害严重影响了作物的产量和品质.ERF(ethylene responsive factor)转录因子是介导生物和非生物胁迫响应的重要调控因子.本实验室从小麦中克隆到抗逆相关ERF转录因子W17基因,本研究以植物表达载体pAHC25为基础,构建了含有反向重复序列的RNAi表达载体pAHC-W17RNAi.采用基因枪法45枪轰击小麦品种新春9号幼胚材料2 379个,共获得115株T0代再生植株,其中12株为阳性转基因植株.半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中W17基因及其调控的下游基因的表达水平均显著下降;表型鉴定发现转基因小麦苗期发育受到抑制.本研究为深入分析小麦ERF基因的功能与作用机制,进而通过分子育种进行小麦抗性改良奠定了基础.     

萝卜过氧化物酶RNA干扰载体的构建及鉴定

萝卜过氧化物酶在植物的生长、发育和防御等多种生理生化过程中发挥着重要作用.利用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)来研究酶功能已日渐成熟.本文根据植物hpRNA(hairpin RNA)的原理,以萝卜过氧化物酶基因rsprx1序列为靶目标, 选择 rsprx1的保守区作为构建RNAi序列,借助中间克隆载体,经过3次亚克隆,最后形成含 rsprx1-RNAi表达盒的双元表达载体pART27-Y2,并转入农杆菌EHA105.     

PiggyBac转座子介导的诱导细胞永生化转基因载体的构建及其整合效率的检测

【目的】构建在小鼠水平上实现多个目的基因的表达以及标记基因安全删除的转基因载体。【方法】以载体为模板,分别扩增SV40P neo、IRES、tk-PloyA,通过overlap PCR连接,并在两端添加方向相同的LoxP序列,构建转基因基本载体PB-NIT;然后通过overlap PCR扩增获得Tet-CMV-SV40 T-T2A-p 53-PolyA基因表达盒,将其插入PB-NIT中,构建载体PB-NIT-STP;最后将转录因子激活域 rtTA 通过同尾酶连接插入PB-NIT-STP,构建载体PB-rtTA-NIT-STP。【结果】经酶切和测序等鉴定,以上载体均正确;经转座活性鉴定,共转染转座子载体PB-rtTA-NIT-STP和转座酶载体比只转染转座子载体获得的阳性克隆数提高了20倍。【结论】得到了基于PiggyBac转座子的可用于正负向筛选和诱导目的基因表达的转基因载体。