新城疫病毒长春株5种结构蛋白基因序列分析

根据已发表的新城疫病毒 (NDV)的核苷酸序列设计了 5对引物 ,采用RT PCR技术 ,分别扩增新城疫病毒长春株基因组中的F、HN、M、P及NP基因 ,并克隆和测定序列。与新城疫弱毒LaSota株和V4株进行同源性比较 ,并对NDV长春株、LaSota株及F48E9株F蛋白分子结构的疏水性及抗原表位分析 ,表明NDV长春株具有新城疫病毒弱毒株的特性。     

狂犬病病毒SRV_9株修饰全长基因组cDNA克隆的构建

为获得狂犬病病毒(rabies virus,RV)SRV9株的基因组全长cDNA克隆并对其进行基因修饰,深入研究狂犬病病毒的基因组特性及构建新型病毒载体,本研究根据GenBank中公布的SRV9基因组序列设计数对引物,以SRV9病毒为材料,从病毒总RNA中将全长基因组11 928 bp分5段扩增,克隆至载体测序鉴定。测序正确后,设计引物缺失基因组Ψ区并在缺失位置插入人细胞色素C基因,又设计引物删除糖蛋白(G)胞质区(CD区)。利用引物在病毒基因组起始处添加锤头状核酶序列,在病毒序列结尾处添加了丁型肝炎核酶序列。再次测序后克隆至pcDNA3.1(+)载体,利用扩增片段自身内切酶位点顺次进行修饰后全长连接,从而获得含修饰SRV9全长基因组的质粒pcDNA3.1-SRV9,为RV感染性克隆的建立奠定了基础。     

口蹄疫病毒L基因真核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达.     

鸽新城疫病毒的分离与鉴定

将分离的疑似新城疫病毒采用蔗糖密度梯度离心对病毒液进一步纯化,经透射电镜观察,可见该疑似病毒具有新城疫病毒直径大小相符的病毒粒子以及囊膜、纤突等形态特征。根据GenBank中注册的新城疫病毒F基因序列分别设计一对特异引物,采用RT-PCR方法扩增相应的目的片段,将cDNA片段分别克隆至pMD-18T载体进行序列测定,获得一株新城疫F基因的部分序列:长度为1625bp,属于基因Ⅶ型,F蛋白氨基酸的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,具有典型的强毒株特征;F0氨基酸序列中有6个糖基化部位点和3个与病毒融合相关的重要抗原位点。     

鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建

用碱裂解法对鹅细小病毒延边分离株进行GPV基因组DNA提取.根据已发表的鹅细小病毒VP3基因序列,设计1对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,以GPV基因组DNA为模板,应用PCR扩增出VP3基因片段,将VP3基因与克隆载体pMD 18-T连接,转化到感受态大肠杆菌BL21中进行克隆.用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAXI真核表达载体中,获得重组质粒pVAXI-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性.     

新城疫病毒HN基因片段原核表达重组质粒的构建

根据GenBank中发表的新城疫病毒F48E9基因序列设计引物,采用RT-PCR技术,成功获得了该病毒HN基因中两个不交叉的基因片段,长度分别为790bp和579bp.将这两段基因分别克隆到pGEM-T vector中,经酶切鉴定和测序后克隆到原核表达栽体pET-28a,PCR和酶切鉴定表明,克隆的两个新城疫病毒基因片段已经正确地插入到了原核表达载体pET-28a之中.     

不同耐热性新城疫病毒株全基因组比较研究

耐热新城疫病毒分子生物学特性研究对于新城疫的防控具有重要意义。从GenBank中检索获得所有已测序的新城疫病毒耐热株全基因组序列和不耐热LaSota株全基因组序列,分别从基因组核酸、结构蛋白氨基酸水平以及囊膜蛋白二级结构、功能位点变化等方面进行生物信息学比较。结果表明:耐热株全基因组序列GC含量略高于不耐热株,基因组中GC分布不均衡,靠近基因组3'端存在GC含量较高区域。耐热株结构蛋白氨基酸组成存在极性氨基酸、杂环族氨基酸以及脯氨酸偏高的现象。耐热株F蛋白理论pI值和不稳定指数均小于不耐热株,二级结构中螺旋区域扩大,折叠区域变小,而HN蛋白理论pI值小于但不稳定指数大于不耐热株,二级结构中螺旋与折叠区域均扩大,且比不耐热株多1个α螺旋。     

新城疫病毒洛阳分离株HN基因真核表达载体的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从新城疫病毒洛阳分离株中扩增出HN基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3真核表达载体上,构建pcDNA3-HN重组质粒。通过用PCR扩增、酶切电泳分析的方法对重组DNA进行鉴定,成功构建了新城疫病毒洛阳分离株HN基因真核表达载体。     

牛粘膜病病毒E1基因的克隆及原核表达

参考BVDVVEDEVAC株的基因组序列及E2基因的测序结果设计一对引物,扩增出预期585 bp的目的片段。扩增产物克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列VEDE-VAC株比较,二者的核苷酸同源性为100%,推导氨基酸同源性为100%。测序结果经同源性比较,克隆得到的基因与VEDEVAC株同源性最高。系统发生树分析推测E1基因与VEDEVAC株在进化上比较接近。将E1基因定向亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中,对阳性重组质粒转化的大肠杆菌BL21进行诱导,E1基因获得了成功表达。     

表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

 【目的】重组新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒（very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV）及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21 d分别以vvIBDV Gx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV－VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120 h,脑内致病指数（ICPI）分别为0.4和0.36,静脉内致病指数（IVPI）均为0;接种后72～96 h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0 EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100％保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90％以上。 【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病－新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。     

鸡新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及进化分析

根据GeneBank中报道的NDV融合蛋白基因(F)序列,设计了一对特异性引物,用该引物对NDVLN-SN株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-F,用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp,编码553个氨基酸;将LN-SN毒株与GeneBank中已报道的NDV毒株进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.4%~99.9%之间,推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88.4%~99.8%之间。     

截短NDV F蛋白的原核表达

根据NDVLaSota株F基因已知的抗原表位,对F蛋白进行分段表达。应用RT—PCR方法分段扩增F基因,并将其克隆到pET30a（＋））原核表达载体上,得到重组质粒pET30-F780和pET30-F760,将质粒导人BL21（ED3）感受态中,经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白通过SDS—PAGE和Westem—blotting方法进行鉴定。表达的两段蛋白大小约为31．1kDa和27．9kDa,与预期的蛋白分子量大小相符。Westernblot分析表明重组蛋白可以和NDV抗体发生特异性反应。成功构建了原核表达质粒pET -F780和pET—F760并获得了高效表达,通过Westernblot分析表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

新城疫病毒SGM01分离株F基因多肽重复区的序列分析和初步表达

从新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）SGM01强毒分离株的F基因克隆出两段七肽重复序列（Heptad Repeat Region,HR）HR1和HR2,通过氨基酸序列分析显示：SGM01分离株的HR1区与F48E9、LaSota的同源性分别为95．2％、93．7％;HR2区与F48E9、LaSota的同源性分别为89．1％、85．5％。将HR1和HR2分别插入融合表达载体pGEX-6p-1,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,得到预期大小的目的蛋白。这为研究HR1和HR2的结构以及其在F蛋白融合过程中所起的作用奠定了基础。     

新城疫病毒V4株NP和P基因及其间隔区序列的克隆与分析

采用RT-PCR技术克隆了新城疫病毒(NDV)V4株长约4 200 bp的核苷酸序列,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列中包含有NDV V4株NP基因编码区、NP和P基因间隔区以及P基因的全部核苷酸序列。NDV V4株NP和P基因与其他8个NDV毒株相应部分进行同源性比较,与Quuesland V4株的同源性最高。NDV V4株NP和P基因间隔区序列与其他13株NDV毒株相应部分的比较结果表明,F48E9等强毒株较La sota等弱毒、无毒毒株和试验用V4株在这个区域多了6个碱基,这6个碱基插入的位置在La sota等弱毒、无毒毒株全基因组序列的1647-1648 nt处;参比的14株NDV在这个区域的同源性为63．9％-100％,弱毒株之间的同源性较高,弱毒株与强毒株之间及强毒株之间的同源性差异较大。     

猪源新城疫病毒SP13株的F基因克隆及序列分析

采用RT-PCR方法对猪源新城疫病毒(NDV)SP13株的F基因进行了扩增与克隆,并测定出F基因的核苷酸全序列,推导出氨基酸序列.F基因全长为1662 bp,单一的开放阅读框,编码553个氨基酸的长肽,裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,与弱毒株在这一区域的序列(112G-R/K-Q-G/S-R-L117)相符;F蛋白有6个潜在的糖基化位点和13个Cys残基位点,其疏水构型有3个强疏水区.通过同源率、系统发育、致病性、疏水性和抗原性等比较分析的结果表明,SP13与LaSota、Clone 30株不但同源性达到99.9%,而且在致病性、疏水性和抗原性等方面也极为相似.     

新城疫病毒F48E9株F1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

新城疫病毒F-HN基因DNA疫苗的免疫效果评价

新城疫是由新城疫病毒引起的一种高度接触性传染病,严重危害全球养禽业.DNA疫苗因其独特的安全、有效等特点将会是解决传统疫苗不足的新途径.为了评价NDV保护性抗原F、HN融合基因的效果,以PBS作为空白对照,将pVAX Ⅰ、pVAX Ⅰ-F、pVAX Ⅰ-HN和pVAXⅠ-F-HN四种质粒肌肉注射2周龄雏鸡,一免后二免.IHA检测免疫期血清样本（1次/7d）抗体效价;二免后,FCM检测外周血淋巴细胞亚群,淋巴细胞增殖实验检测脾细胞淋巴细胞增殖情况;免疫完毕14d后用105 EID50的lasota株NDV滴鼻攻毒,统计发病率、死亡率.结果：F、HN融合基因诱导机体体液免疫和细胞免疫水平显著提高,攻毒后pVAX Ⅰ-F组保护率为30％,pVAX Ⅰ-HN组为46.7％,pVAX Ⅰ-F-HN组保护率为93.3％,表明F、HN融合基因DNA疫苗具有明显的免疫效果.