雏鸭感染坦布苏病毒后对其生长性能和血液生化指标的影响

将200只1d龄雏鸭随机分为2组,攻毒试验组150只,对照组50只,自由采食,预饲7d。8d龄时按100ELD50感染剂量进行雏鸭攻毒,攻毒7d内每日称取体质量并采血分离血清进行生化指标检测。攻毒3d后攻毒组体质量与对照组存在显著差异(P<0.01),攻毒组谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰胺转移酶(GGT)、胆碱酯酶(CHE)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐(Cre)、尿酸(UA))等指标各自在不同时间阶段与对照组存在显著差异(P<0.01)。所以雏鸭感染坦布苏病毒后不仅对其生长产生抑制,而且对机体器官尤其是肝脏和肾脏的性能造成影响。以上研究雏鸭感染坦布苏病毒后对其生长性能和血液生化指标的影响,为鸭感染坦布苏病毒的致病机理提供了理论依据。     

新城疫GM2分离株蚀斑克隆纯化及毒力测定

新城疫（newcastle disease,ND）是世界公认的最重要的家禽疫病之一,伴随着NDV活疫苗的广泛使用,野外分离的新城疫病毒往往由多种强弱病毒混合而成。为了避免不同分离株干扰,必须通过蚀斑纯化将混杂在一起的不同NDV毒株区分开来。文章采用蚀斑纯化技术对野外分离毒新城疫GM2进行蚀斑纯化,并对蚀斑纯化前后病毒的生物学特性进行测定,结果显示,该分离毒蚀斑纯化前MDT,ICPI,IVPI分别为50.5,1.78,2.41,蚀斑纯化后MDT,ICPI,IVPI分别为47.5,1.89,2.65。     

核酸探针检测山东省鸡群中马立克病毒、传染性贫血病毒、网状内皮增生病病毒和呼肠孤病毒的流行状况

为对山东家禽业免疫抑制病的流行情况进行调查,从烟台、滨州、临沂、泰安、聊城、青岛大型养殖场共随机收集600只病死鸡的肝脏和脾脏病例组织样品,用斑点杂交的方法检测样品中鸡马立克病毒（Marek’s disease virus, MDV）、传染性贫血病毒（chicken anemia virus,CAV）、网状内皮增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)和呼肠孤病毒（reovirus,REOV）的感染情况。结果发现,MDV、CAV、REV、REOV的感染率分别为5.17%、8.17%、1.17%、2.5%,检出率较以前的研究报道有降低趋势,有多种双重感染和三重感染,表明山东家禽业在免疫抑制病方面总体控制较好,但不同的养殖场发病情况差异极显著,管理水平参差不齐,个别地区发病情况严重,检出率超过其他地区的总和。     

肉鸽新城疫病毒山东分离株的分离鉴定及其F基因的分子特性分析

从山东某发病肉鸽的体内分离到一株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV),命名为Pigeon-Shandong-JN-08(简写JN08),对其融合蛋白(fusion,F)进行序列和分子特性的分析,以了解肉鸽NDV的遗传起源和分子特性。JN08经病毒蚀斑克隆纯化后动物回归试验可产生典型的NDV病变。研究结果发现,F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合鸽源NDV强毒氨基酸基序。F基因分型及同源性比较显示:JN08与绝大多数鸽源毒株同属于基因Ⅵ型;其F基因与基因Ⅱ型毒株LaSota,B1,Bingham,TEX-48氨基酸同源性为89.9%,89.7%,90.4%,89.7%,与基因Ⅰ型毒株Ulster67的氨基酸同源性为91.3%,与基因Ⅲ型传统强毒F48E9的氨基酸同源性为92.8%;与国内鸽分离株P1-03,CH98-98,JS1-06,PB01-96和GZ-07的氨基酸同源性分别为91.3%,94.6%,94.8%,95.1%,94.0%;与国外鸽分离株Capital3-97,Tigre6-99,1166-02,IT227-97,2736-00,NY-84,TX3503-04,248VB-98的同源性分别为96.2%,93.8%,98.0%,96.8%,97.1%,96.8%,96.8%,98.4%。从F基因遗传进化树上发现:JN08与国外分离株的遗传距离较近,处于同一基因亚型上,而与国内分离株的遗传距离较远。     

鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株的选育

【目的】将鸭坦布苏病毒BZ_2010株在SPF鸡胚上进行连续传代致弱,旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以SPF鸡胚为增殖宿主,将BZ_2010株连续传代,直至第120代,以1日龄雏鸭和30周龄的产蛋种鸭为试验对象,对第120代次毒株（命名为VC2）的安全性进行评价;以1d雏鸭为试验对象,对VC2株的返强情况进行评价;以18周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的中和抗体进行监测;以25周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的保护效果进行评价;利用RT-PCR方法分别扩增BZ_2010株和VC2株的E基因和NS4A基因,进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐缩短,而病毒毒价有逐渐提高的趋势,ELD50由第20代的10^-5.3/0.1mL提高到第120代的10^-5.8/0.1mL,而且第80代之前提高较快,后期基本稳定。将VC2株通过颈部皮下接种1d雏鸭和肌肉接种30周龄产蛋种鸭,接种后试验鸭无异常临床表现,肝脏也无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的安全性。将VC2在1d雏鸭进行连续5次传代,未发现试验鸭有任何异常症状,将第5代组织悬液接种1d雏鸭,采集肝脏进行病理切片观察,发现无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的稳定性。基因测序分析结果显示,VC2株 E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸发生改变,而NS4A蛋白只有一个氨基酸发生突变,即第54位氨基酸由F变为L。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,第4周即可达到高峰,并且维持较长时间;VC2免疫后于第2周和第50周利用强毒株进行攻毒试验,结果VC2免疫组在攻毒后未出现异常症状,粪便正常,产蛋率保持正常,这说明VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。【结论】本研究通过鸡胚连续传代成功获得了一株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,可维持较长时间。攻毒试验结果表明,VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。     

一株水貂犬瘟热病毒的分离与鉴定

为寻找免疫失败的原因,有效防治犬瘟热的流行,对临床一水貂犬瘟热疑似病例,取其肝、脾、脑等组织研磨后接种Vero和BHK细胞分离病毒,并对分离毒株进行一系列鉴定。通过电镜观察,发现了大小约150 nm的副黏病毒样粒子。结果表明,分离株对鹅、鸡、小鼠、家兔、山羊、猪红细胞均无凝集性,该分离株的毒价TCID50为10-4.87;分离株病毒对乙醚、氯仿敏感,病毒的核酸型为RNA。经间接免疫荧光试验,接种病毒的BHK细胞出现特异性的亮绿色荧光。对分离株和对照毒株分别提取RNA进行RT-PCR扩增,最后得到与预期扩增片段(294 bp)相符的核酸电泳带,充分证明分离病毒为犬瘟热病毒。     

禽腺病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

禽腺病毒4型(FAdV-4)是心包积水综合征的重要病原。本研究拟建立FAdV4荧光定量PCR检测方法,为FAdV4感染的流行病学调查、早期诊断、疫病净化提供技术手段。根据GenBank中的禽腺病毒4型六邻体(hexon)基因序列,设计一对引物,扩增hexon基因,将目的基因与载体pEASY-T3连接,构建重组阳性质粒pEAST-T3-H,利用所制备的质粒pEAST-T3-H为模板,对PCR反应体系、反应条件进行优化。建立了禽腺病毒4型SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,检出的标准品的敏感性为1.7×10拷贝/μL,优于常规的PCR检测方法。该方法与其他禽病病毒均无交叉反应。表明该方法具有特异型强、灵敏度高、重复性好的特点,可用于临床样本的检测。     

一株APMV-4毒株的分离鉴定及其PCR检测方法的建立

2017年初从病鸭体内分离到了一株具有血凝性的血清4型禽副黏病毒(Avian Paramyxovirus type 4,APMV-4)。随后建立起针对APMV-4的一步法RT-PCR检测方法 ,结果表明该方法可特异性地区分APMV-1和APMV-4毒株。     

一株野禽新城疫强毒分离株的分子特性及其对不同宿主的致病性

新城疫(newcastle disease,ND)是禽类的两大疫病之一,新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是该病的病原体。为了解野禽NDV的分子特性、致病性及其与家禽NDV之间的关系,2011年分离到一株野禽NDV,将其命名为NDV2;通过标准生物学毒力检测证实其为强毒株。参照GenBank发布的NDV全长基因序列设计9对特异性引物,对NDV2进行全基因的序列测定和分析。拼接后序列分析表明,NDV2株的全基因组序列总长为15 192 nt,包含6个开放阅读框,分别编码6种蛋白nucleocapsid protein(NP)、phosphoprotein(P)、matrix protein(M)、fusion protein(F)、haemagglutinin-neuraminidase(HN)和large protein(L)的基因,长度分别为1 753、1 451、1 241、1 792、2 004和6 703 nt(GenBank登录号:KF306265)。与国内多数禽源分离毒株相似,NDV2毒株亦属于ClassⅡ、基因Ⅶ型。综合各个蛋白的同源性比较,NDV2株与近年国内流行的一些基因Ⅶ型毒株如:Egret.GX.11、Duck.WF.00、Goose.GD450.11等的同源性较高,远高于其他地区和其他基因型的毒株,这说明NDV2毒株与国内的野毒株亲缘性较高;与NDV2同源性差距最大的为ClassⅠ的JS10毒株。F基因的裂解位点显示:全基因长度为15 192nt的毒株(包括NDV2毒株在内)在裂解位点处的氨基酸序列为RRQKRF或KRQKRF,为强毒株序列。从基因分型结果来看,NDV2毒株和绝大多数参考毒株F基因和HN基因分型结果是一致的;唯一不同的就是印度鸡源分离株NDV4毒株,F基因分型它属于Ⅱ型,HN基因分型它属于Ⅶ型。分析各个基因的起始序列和终止序列后发现:NDV2株与其它参考NDV毒株的各个基因的起始序列完全相同,说明各基因起始序列保守性较高;不同之处是NDV2毒株F和HN基因的终止序列与La Sota和Sweden95一致,与其他野禽毒株不同。以NDV2人工感染无特定病原(Spicific pathogenfree,SPF)鸡(Gallus gallus)、鸭(Anas platyrhynchos platyrhynchos Linnaeus.)和鸽(Rupestris Pallas),并且每个攻毒组设同居感染组;来观察NDV2毒株对不同宿主的致病性。结果表明,NDV2毒株均可引起3种攻毒动物发病,剖解后肠道、腺胃、气管等处有淤血、出血现象;而且病毒对鸡和鸽的致病性明显高于鸭。同时NDV2毒株可引起50%同居鸡和20%同居鸽感染发病,不能引起同居鸭发病。本研究为NDV的遗传变异特征和致病规律等方面提供基础资料。     

不同白油佐剂制备的H9N2灭活疫苗在SPF鸡上的免疫效果初试验

为了比较不同厂家的注射用矿物白油佐剂的免疫效果,试验采用3个不同黏度的国外白油样品,按照《中华人民共和国兽药典》进行注射用白油质量检验、制备3批H9N2油乳剂灭活疫苗,分别以0.3ml/只剂量,胸部肌肉注射接种28日龄SPF鸡,接种后14d、21d、28d、35d、42d分别进行疫苗的药物残留吸收检查和血清抗体效价检测。结果表明:3种佐剂疫苗的安全性、稳定性均良好;应用WG40白油佐剂的灭活疫苗,免疫SPF鸡产生的H9N2禽流感HI抗体水平优于其它两种佐剂,免疫3周后检测到的H9N2禽流感抗体水平均合格,WG40确定为最佳白油佐剂。