犬瘟热病毒蓝狐株的分离鉴定

为了对狐犬瘟热的防治提供参考依据,试验通过观察接种分离病毒细胞的细胞病变(CPE)情况,结合反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、核苷酸序列同源性分析对从疑似犬瘟热死亡的蓝狐脾脏中分离出的病毒进行了鉴定。结果表明:该毒株可使培养细胞出现明显的细胞病变。提取感染细胞的总RNA进行RT-PCR,扩增出1 044 bp的融合蛋白基因片段,大小与预期值相符;分离毒株与GenBank中已发表的10株犬瘟热毒株核苷酸序列同源性为92.9%～97.1%,氨基酸序列同源性为96.3%～97.7%。说明分离株为犬瘟热病毒。     

犬瘟热病毒山东株的分离及N蛋白基因的克隆与序列分析

本试验采用Vero细胞从临床疑似患犬瘟热的犬组织病料中分离出一株病毒,通过观察细胞病变,提取细胞培养物RNA并扩增克隆分析N蛋白基因部分序列进行了鉴定。结果表明,该毒株接种于Vero细胞后,出现了典型的细胞病变;对接种病料后的Vero细胞培养物提取总RNA进行RT-PCR扩增,得到了287 bp的目的片段;序列分析表明该分离株与犬瘟热病毒弱毒(Onderstepoort和Snyder Hill)的同源性为95.5%~96.9%,与标准强毒株(A75/17和2544/Han95)及野毒株(XJ-4、ZJ7、98-2646等)的同源性较高,为97.2%~99.0%,证明该毒株为犬瘟热病毒野毒株,命名为QD10。     

貉源犬瘟热病毒的分离鉴定

采集大庆某貉养殖场病貉的病料,处理后接种于非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离。对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定,并用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测感染细胞中的病毒核酸。病料接种 Vero 细胞 72 h 后产生明显的细胞病变(CPE);病毒分离株可以被犬瘟热病毒阳性血清中和,中和效价为 1∶25;分离株对氯仿、乙醚敏感,对酸和热抵抗力弱,可以凝集鸡红细胞,其凝集作用可被犬瘟热病毒阳性血清所抑制; RT-PCR检测病毒细胞培养液,扩增出的片段长287 bp,与预期设计的长度相同,经测序发现与MS01株的同源性为99%。结果表明,分离的病毒株为犬瘟热病毒,命名为CDV-DQ株。     

稳定表达SLAM受体的Vero和BHK21细胞系的建立及其对犬瘟热病毒分离效果的比较

旨在构建稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,并比较其对犬瘟热病毒(CDV)野毒株的敏感性,为CDV野毒株的快速分离与研究提供一种有效的工具。将真核表达载体Pcag-SLAM分别转染Vero细胞和BHK21细胞。经G418压力筛选结合有限稀释法筛选阳性克隆株,并通过RT-PCR、间接免疫荧光鉴定(IFA)和Western blot等方法对稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系加以验证。应用这两种细胞系对3例临床犬瘟热病例的5种不同组织进行病毒分离,对分离得到的CDV进行RT-PCR及IFA鉴定。结果显示,经RT-PCR和Western blot验证,本研究成功构建出SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,SLAM-Vero细胞接种病毒12~24h即可出现典型的CDV导致的细胞融合体CPE,利用SLAM-Vero细胞从3只CDV阳性犬的肺和脾中分离得到2株CDV,而SLAM-BHK21细胞、亲本Vero细胞及亲本BHK21细胞未能分离出病毒。研究表明,与SLAM-BHK21细胞相比,SLAM-Vero细胞对CDV的分离率较高,并能产生明显的CPE。在分离CDV野毒株时,选择肺和脾更容易在SLAM-Vero细胞系上分离出病毒。     

犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定

选取来自黑龙江省病犬的肺脏、胰脏、肝脏、脾脏、肾、膀胱、淋巴结等组织病料,研磨上清接种非洲绿猴肾细胞（Vero）进行病毒的分离。对分离毒株进行了形态学、血清学、回归动物试验鉴定,并用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测感染细胞中的病毒核酸。分离得到的病毒在Vero细胞上可产生明显的细胞病变（CPE）,病毒形态学、血清学、回归动物试验、RT-PCR鉴定均为阳性,确定所分离的病毒为犬瘟热病毒,命名为CDV-HLJ株。     

猪伪狂犬状病毒S1株的分离与鉴定

从上海事某猪场发效仔猪体内分离到1株病毒，该毒株能在鸡胚成纤维细胞，RK，Vero,BHK21,ST,PK15细胞上增殖并产生细胞病变，通过蚀斑克隆对其进行纯化，克隆毒株在BHK21细胞上的TCID50为50μL10^-6.68稀释液，该病毒能被伪狂犬病毒（PRV）阳性血清中和，接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应，电镜观察可见直径110－180nm的典型疱疹病毒粒子，用该病毒接种兔仔猪均出现典型的伪狂犬病症状，表明该分离毒株为PRV。     

贵州犬瘟热病毒的分离鉴定

对流行病学调查、临床症状检查和ELISA检测为犬瘟热阳性的自然发病犬,取肠内容物为病料,采用同步培养方法接种于犬肾细胞系(MDCK)进行病毒的分离,并对分离株进行了形态学特征、血凝特性、动物感染及RT-PCR鉴定。结果表明:病料接种MDCK细胞产生明显的细胞病变(CPE),电镜负染观察接毒细胞培养物见有典型的犬瘟热病毒粒子。分离株不凝集鸡及人“O”型红细胞,接种犬出现明显的临床症状和病理变化。用RT-PCR技术检测病毒细胞培养液,扩增出的片段长为760 bp,与预期设计的长度相同,由此确证分离株为犬瘟热病毒,命名为CDV-GZ2株。     

水貂源犬瘟热病毒的分离及鉴定

为了研究当前犬瘟热的流行毒株,试验选取来自辽宁省大连市疑似犬瘟热发病死亡水貂的肺脏、脾脏、肾脏等组织,将研磨匀浆后的上清液接种于稳定表达犬瘟热SLAM受体的非洲猕猴肾细胞系-Vero/DogSLAM(VDS),通过病料的处理、VDS细胞的复苏与培养、病毒的分离与培养、病毒TCID_(50)的测定、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法检测感染细胞中的病毒核酸,用序列比对的方法与已发表的犬瘟热病毒H蛋白(CDV-H)和SLAM受体结合区(RBS)序列进行比对分析,用CDV-H蛋白间接免疫荧光(IFA)的方法检测荧光蛋白表达。结果表明:在Vero/DogSLAM(VDS)细胞上接种病毒培养24 h后,80%～90%的VDS细胞出现合胞体病变(CPE),分离到的病毒TCID_(50)达到1×10~(5. 23)/(100μL),同时检测的CDV-H和SLAM受体结合区(RBS)序列比对分析一致,同源性为98%以上,在细胞质中可观察到抗CDV-H蛋白的特异性绿色荧光,RT-PCR成功扩增出H基因部分片段。说明本试验成功分离并鉴定出1株犬瘟热毒株,将其命名为LNDL(17) M4株。     

1株貉源犬瘟热病毒的分离鉴定

为筛选貉源犬瘟热毒株,从取皮期乌苏里貉肺脏中收集巨噬细胞,通过ELISA试验筛选阳性样本,用Vero细胞分离培养,获得1株貉源犬瘟热病毒.提取RNA进行RT-PCR和F基因测序分析鉴定,结果证明,该毒株确为犬瘟热病毒,命名为CDV/R-20/12.为下一步的貉源犬瘟热疫苗的研究与制备奠定了基础.     

猪伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及UL43基因序列分析

从四川某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该毒株能在Vero、MDBK、PK15、ST、MDCK、BHK21、Marc145、鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化,克隆毒株在Vero细胞上为3.0×107TC ID50/0.1mL。该病毒在Vero细胞上连传15代,其TCID50变化很小。病毒对5-溴脱氧尿核苷、氯仿敏感。用该病毒接种家兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状,gE-ELISA检测接种分离毒的仔猪血清,伪狂犬病毒(PRV)抗体阳性。电镜观察可见直径110～140 nm的典型疱疹病毒粒子。上述结果表明分离株为PRV,并命名为SE株。根据已发表的UL43序列设计1对引物,以分离毒株基因组DNA为模板进行PCR扩增,对目的产物进行克隆及测序分析,结果与GenBank收录的其他PRV毒株(Becker、Ea)的UL43核苷酸序列同源性为98.8%,氨基酸同源性分别为95.2%、97.3%。     

An unusual presentation of canine distemper virus infection in a domestic ferret (Mustela putorius furo)

A 4.5-year-old, male castrated ferret was examined with a 27-day history of severe pruritus, generalized erythema and scaling. Skin scrapings and a trichogram were negative for mites and dermatophyte organisms. A fungal culture of hair samples was negative. The ferret was treated presumptively for scabies and secondary bacterial and yeast infection with selamectin, enrofloxacin, fluconazole, diphenhydramine and a miconazole–chlorhexidine shampoo. The ferret showed mild improvement in clinical signs over the subsequent 3 weeks, but was inappetent and required supportive feeding and subcutaneous fluids by the owner. The ferret was then examined on an emergency basis at the end of 3 weeks (53 days following initial signs of illness) for severe blood loss from a haematoma over the interscapular region, hypotension and shock. The owners elected euthanasia due to a poor prognosis and deteriorating condition. On post-mortem examination intraepithelial canine distemper viral inclusions were identified systemically, and abundant canine distemper virus antigen was identified with immunohistochemical staining. It is important to note the prolonged course of disease along with the absence of respiratory and neurological signs because this differs from the classic presentation of canine distemper virus infection in ferrets. Canine distemper virus should remain a clinical suspicion for ferrets with skin lesions that do not respond to appropriate therapy, even in animals that were previously vaccinated.     

水貂和狐犬瘟热病毒F基因的克隆与序列分析

为探寻免疫失败的原因,对山东某养殖场免疫后的发病水貂和狐犬瘟热组织病料分别提取RNA进行RT-PCR扩增。将PCR得到的部分F基因克隆到pMD18-T载体上测序,并与疫苗株ND进行序列分析。结果表明,水貂和狐的CDV与OND的核苷酸同源性为98.6%9、8.6%,氨基酸同源性为98.0%9、8.0%。水貂和狐两者核苷酸同源性为98.0%,氨基酸同源性为95.9%。     

犬瘟热病毒单克隆抗体的研制及胶体金试纸条检测方法的建立

本研究利用原核表达、纯化的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)N 蛋白免疫BALB/C小鼠,成功筛选到两株分泌CDV N 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为D3、D6。2株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体敏感性、特异性良好,能识别不同来源的犬瘟热病毒株,单抗亚类均为IgG1。以D3作为金标抗体,D6作为检测抗体,兔抗鼠IgG作为质控线抗体,制备犬瘟热病毒胶体金检测试纸条,检测犬瘟热病毒敏感性为1000TCID50,能有效检测区分犬瘟热病毒、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬腺病毒2型(Canine adenovirus type 2,CAV2)、狂犬病病毒(Rabies virus,RV)。综上,本研究建立的胶体金试纸条检测方法,灵敏度高、特异性强,适用于犬瘟热病毒临床快速诊断。     

小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列的克隆及序列分析

本研究对军事兽医研究所病毒二室分离驯化后的小熊猫源犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因组进行全序列测定,并对其基因组特征及H基因遗传稳定性进行比较分析。根据GenBank公布的犬瘟热病毒全长基因组序列设计合成17对特异性引物,以小熊猫源犬瘟热病毒总RNA为模板,RT-PCR进行分段扩增,并克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经测序、拼接获得全长cDNA序列。结果显示,小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列与GenBank登录号分别为AF014953、AY445077、AY542312、AY466011、AY386316、AF164967、EU716337、EU726268、AY443350、AB474397、GU138403和AY649446的12个不同毒株全基因序列的同源性分别为86.6%、92.4%、92.5%、92.5%、94.3%、96.3%、95.9%、87.1%、94.5%、92.3%、87.4%和94.6%,与标准强毒株A75/17株(AF164967)的亲缘关系最近,全基因同源性达96.3%,但与疫苗株Onderstepoort(AF014953)亲缘关系相对较远,同源性为86.6%。小熊猫源犬瘟热病毒H基因与其他不同地区具有代表性的30株CDV进化树分析显示,小熊猫源犬瘟热病毒属于Asia Ⅰ型,H蛋白中309－311位氨基酸残基所形成的潜在糖基化位点,为疫苗株没有而野毒株所共有的,并且可能与病毒的免疫原性有关。因此,致弱的小熊猫源CDV在预防免疫的针对性上可能强于已有的疫苗株。     

急性犬瘟热感染组织脏器的研究

临床中犬瘟热多分为急性和亚急性,3月龄犬多发本病,急性病例和亚急性病例的临床症状和病毒复制的脏器与慢性病例有很大区别。临床上急性病例的病变主要集中在肺脏和淋巴组织,组织病理学可观察到淋巴结炎和多核巨细胞性肺炎。根据免疫组织化学染色结果发现,在犬瘟热急性病例的淋巴结皮质中犬瘟热抗原呈强阳性,且密度很高。而病犬虽然表现出严重的肺炎症状,但在犬的肺脏中犬瘟热病毒抗原阳性反应弱,仅在支气管上皮和少量的巨噬细胞胞浆中观察到。犬瘟热病毒首先在犬的淋巴组织中进行复制、增殖,破坏被膜下淋巴窦和淋巴小节中的T淋巴细胞和B淋巴细胞,影响淋巴组织输出到外周血液循环中的淋巴细胞数量。本研究结果表明,犬瘟热虽然临床上以肺脏病变最严重,但在急性和亚急性病例,犬瘟热病毒主要在淋巴组织的T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞中增殖,故应以淋巴组织作为犬瘟热病毒的主要分离脏器。     

TaqMan探针荧光RT-PCR检测狂犬病病毒

根据GenBank已公布的狂犬病病毒(rabies virus,RV)核蛋白(N)基因序列设计并合成一对特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的荧光RT-PCR检测狂犬病病毒方法。对狂犬病疫苗提取核酸后进行RT-PCR扩增,将目的条带切胶回收,克隆测序,重组质粒作为标准阳性对照。对建立的TaqMan探针荧光RT-PCR方法做灵敏度、特异性、重复性及稳定性试验。结果显示,该方法可以达到10拷贝/μL的灵敏度,可以将狂犬病病毒与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒和犬副流感病毒分开,方法重复性好,稳定可靠。